[发明专利]一种消除副产物的重组结节链霉菌、构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：由如下方法构建获得：以结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426为底盘菌，突变其聚酮合酶ER5结构域关键结催化位点，将其氨基酸序列中的QSFDLAFVDPEVIGAMGR突变为QSFDLAFVAPEVIGAMGR获得。本发明有益效果主要体现在：(1)本发明获得的突变菌株具有完全不产副产物AmA的特性，便于工业化生产分离纯化；(2)本发明获得的突变菌株具有较高的两性霉素B产量。

(一)技术领域

本发明属于代谢以及酶工程领域，具体涉及一种通过使关键酶失活消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌、构建方法及应用。

(二)背景技术

两性霉素B(AmphotericinB，AmB)是重要的抗真菌类抗生素，自1966年上市以来，一直是深部真菌感染的首选药物。AmB纯品的颜色为黄色或橘黄色，由于其分子结构中亲水基团与疏水基团的不对称分布和带有酸碱性的特点，使得AmB在水相及大部分有机相中的溶解度极低。AmB抗真菌谱广、活性强，对念珠菌、隐球菌、毛霉菌、曲霉菌、组织胞浆菌、球孢子菌等大多数深部真菌都有很强的抗真菌作用，还能有效抑制假丝酵母菌和用于治疗利什曼病等，因此两性霉素B及其衍生物的应用仍然非常广泛。

两性霉素B(Amphotericin B，AmB)是由结节链霉菌(Streptomyces nodosus)产生的一种七烯大环内酯类抗生素。AmB分子式C47H73NO17，分子量为924.09，是一种橙黄色或黄色结晶粉末，无气味，易吸水，在光照下易分解失。菌株在生产过程中还会产生抗菌活性低的两性霉素A(Amphotericin A，AmA)，AmA与AmB结构上的唯一区别在于C28-C29之间的碳碳键，两者结构式如图1所示。AmB在紫外波长405nm具有吸收峰，而AmA在紫外波长305nm下具有吸收峰，故可这两个波长下区分检测该物质。都不溶于水，可溶于二甲基亚砜(DMSO)和甲醇，几乎不溶于乙醇、丙酮、苯等物质。

基因水平的多组学分析及分子生物学技术的革新，运用基于基因分子水平的基因工程育种将是一种精准快速高效的育种方法。随着S.nodosus菌株的全基因测序，AmB合成过程的关键基因被解析，通过基因工程的方法理性构建高产AmB的工程菌株更具合理性。构建链霉菌次级代谢产物的高产菌株研究中，普遍为对次级代谢网络的调控、过表达合成前体相关的酶及过表达基因簇中的关键酶等策略来提高链霉菌中次级代谢产物产量，在发酵生产过程中，基于次级代谢产物生物合成过程解析，通过添加前体物质及关键差异代谢物，将作为进一步提高次级代谢物产量的策略被广泛应用。

(三)发明内容

本发明目的是提供消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌、构建方法及其应用，通过对结节链霉菌聚酮合酶ER5结构域催化位点突变，获得消除副产物AmA生成工程菌株，消除副产物后能提升AmB的产量。

为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：以结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426为底盘菌，突变其聚酮合酶ER5结构域关键结催化位点，将其聚酮合酶ER5结构域氨基酸序列中的QSFDLAFVDPEVIGAMGR突变为QSFDLAFVAPEVIGAMGR，得到结节链霉菌ZJB2016050-N1，即所述消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌。

具体的，所述的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：

以结节链霉菌(Streptomyces nodosus)CCTCC NO：M 201742为底盘菌，将其聚酮合酶ER5结构域氨基酸序列中的QSFDLAFVDPEVIGAMGR突变为QSFDLAFVAPEVIGAMGR，得到结节链霉菌ZJB2016050-ER5N1，所述聚酮合酶ER5结构域基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及构建所述重组结节链霉菌的方法，所述方法如下：