[发明专利]一种低氧诱导分泌乳酸氧化酶的大肠杆菌工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种低氧诱导分泌乳酸氧化酶的大肠杆菌工程菌及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供的工程化大肠杆菌能够在体外及培养基条件下，遇到低氧环境时响应性合成乳酸氧化酶，乳酸氧化酶能够分解局部的乳酸产生过氧化氢，进而起到对细胞、局部细菌的杀伤。这一过程在治疗了局部病症的同时，会使大肠杆菌载体随着培养也被杀死，能够降低本工程化大肠杆菌导致的外源感染风险，使工程化大肠杆菌整体表现为一种较安全的疾病治疗菌种。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种低氧诱导分泌乳酸氧化酶的大肠杆菌工程菌及其应用。

背景技术

质粒(plasmid)是染色体外遗传因子，能够进行自主复制，不具有胞外期，非寄主细胞生长、代谢、繁殖等生命活动必须，但能赋予宿主细胞某些特殊属性。质粒对大肠杆菌的转化过程简便，如电刺激、热刺激、高浓度氯化钙均能让大肠杆菌转化为感受态细胞，摄入质粒，并在正常条件下维持质粒稳定。同时，基于DNA内切酶的技术，质粒中的一些特殊序列很容易被DNA内切酶切开，随后可以在其中插入特定的DNA序列，即实现对质粒的可控设计。该过程可使质粒具备合成诸多蛋白质的对应基因序列。在将其转化入细菌后，即可令细菌生产特定的蛋白质。

启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。部分启动子具有外场诱导性，在一些环境刺激下，会诱导进行转录功能，如自然界中存在一些热诱导启动子(例如Tcl)、辐射诱导启动子(例如Egrl)。自然界中还存在一些乏氧启动子，如PSnirB。PSnirB是一种来源于肠道沙门氏菌的厌氧诱导启动子，在乏氧条件下，该启动子的活性显著提升。

乳酸氧化酶能够氧化乳酸生成丙酮酸和过氧化氢，由于反应过程中不需要外源辅酶作为电子受体，具有较好的应用前景。然而，游离的乳酸氧化酶稳定性很差易失活，特别是如果在体液中，极易被血液中的蛋白酶水解失活。如何有效递送乳酸氧化酶至作用部位，或在需要作用的部位响应性产乳酸氧化酶，在疾病治疗领域一直是一项难点。

低氧气浓度是许多疾病病灶区的特性，如肿瘤因快速生长代谢、坏疽因缺乏血供导致的低氧等。而低氧气浓度给组织带来的一大特性，即乳酸的积聚。

乳酸氧化酶催化乳酸产生的过氧化氢是一种常见的活性氧(ROS)，过氧化氢具有较高的氧化势，对细胞、细菌均有一定杀伤作用。

将质粒转化进大肠杆菌，构建乏氧响应性合成乳酸氧化酶的大肠杆菌，令其在乏氧环境原位合成乳酸氧化酶，催化局部乳酸生产过氧化氢，实现对细胞、细菌的杀伤，将会是种能有效利用乳酸氧化酶，摆脱其易失活特性的理想方式。

发明内容

有鉴于此，本申请目的是提供一种低氧诱导分泌乳酸氧化酶的大肠杆菌工程菌及其应用，同时提供一种能够低氧响应性分泌乳酸氧化酶工程化大肠杆菌的制备方法，以及此工程化过程使用的质粒核苷酸序列。

具体得技术方案如下：

本发明提供了一种低氧诱导分泌乳酸氧化酶的大肠杆菌工程菌，以大肠杆菌作为出发菌，通过导入载有低氧诱导启动子、分泌肽基因和乳酸氧化酶基因的质粒构建得到所述大肠杆菌工程菌。

所述低氧诱导启动子为来源于猪霍乱沙门菌(Salmonella Choleraesuis)C500的厌氧诱导启动子PSnirB，来源于猪霍乱沙门菌C500的FNR启动子家族，分泌肽基因为来源于果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)的分泌肽基因pelB，是大肠杆菌中常见信号肽序列，乳酸氧化酶基因为来源于海豚链球菌(Streptococcus iniae)的乳酸氧化酶基因lcto，乳酸氧化酶基因lcto序列并根据大肠杆菌密码子偏好性优化，以提高其在大肠杆菌中的表达效率。

优选的，所述低氧诱导启动子的序列如SEQ ID NO.1所示，分泌肽基因序列如SEQID NO.3所示，乳酸氧化酶基因序列如SEQ ID NO.2所示。