[发明专利]一种防治烟草青枯病的放线菌固态菌剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种防治烟草青枯病的放线菌固态菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、采集烟田根围土壤；

S2、取土壤样品加水，搅拌混匀，静置取上清液，稀释至不同浓度，将不同浓度土壤溶液均匀涂布于高氏1号培养基平板上，分离获得纯化放线菌株；

S3、将所述纯化放线菌株采用平板对峙法筛选出具有青枯病原菌拮抗作用的放线菌菌株；

S4、将所述具有青枯病原菌拮抗作用的放线菌菌株用高氏1号液体培养基传代培养，再接种到发酵培养基中进行高密度发酵扩大培养以获得液体菌种，再通过管式离心机进行固液分离，获得放线菌菌泥；

S5、将所述放线菌菌泥与改性淀粉吸附载体混合，并添加冷冻保护剂，冷冻干燥，获得放线菌固态菌剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高氏1号培养基的具体配方是可溶性淀粉20g，NaCl0.5g，KNO₃1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄0.01g，琼脂16g，水1000mL，调节pH至7.2～7.4，使用时，每300mL培养基中加1mL3％或14mL2.5％的重铬酸钾以抑制细菌和霉菌的生长。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高氏1号液体培养基为1％胰蛋白胨、0.05％酵母提取物、1％NaCl，pH调节至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为葡萄糖1％，酵母膏0.4％，蛋白胨0.4％，K₂HPO₄0.4％，KH₂PO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O0.05％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高密度发酵扩大的培养条件为pH起始7.3，接种量0.5％，培养温度28℃，接种量3-5％，发酵罐装液量60-80％，搅拌转速180r/min，无菌空气通气量1.5ms/h，罐压0.05Mpa，流加50％葡萄糖控制底糖浓度在0.5％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述改性淀粉吸附载体的改性过程具体为为：

(1)将木薯淀粉悬浮在0.1mol/L的醋酸酯缓冲液中获得木薯淀粉悬浮液，所述木薯淀粉和醋酸酯缓冲液的比例为1:4；

(2)混合具有热稳定性的α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶获得混合酶液，所述α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶的混合比例是5:1；

(3)将所述木薯淀粉悬浮液和混合酶液混合，所述木薯淀粉悬浮液和混合酶液混合比例是50：1，在55℃下，100r/min条件下反应6小时，用2.2MHCl调节pH为1.5～1.6，停止酶活15min，用清水清洗至pH为6。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂的成分是海藻糖2％、甘露醇1％、三聚磷酸钠0.5％、透明质酸0.01％。

8.如权利要求1～7任一项所述的制备方法获得的防治烟草青枯病的放线菌固态菌剂。

9.如权利要求8所述的防治烟草青枯病的放线菌固态菌剂在防治烟草青枯病中的应用。