[发明专利]一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法

权利要求书

1.一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1、构建CRISPR-Cas9质粒：

构建CRISPR的敲除质粒pCas9-PAR2，采用鼠源PAR2的CRISPR质粒，鼠源F2RL1sgRNA序列如SEQ ID No：2所示；

S2、将人血清白蛋白溶于纯水中，调节pH为8；将人血清白蛋白溶液、聚乙烯亚胺溶液、pCas9/PAR2混合，控制聚乙烯亚胺的氮与质粒的磷酸盐的氮磷比为16:1，涡旋数十秒，静置数十分钟；

S3、在搅拌条件下，向步骤S2得到的混合溶液中加入乙醇溶液，继续搅拌30分钟，再加入戊二醛水溶液，搅拌30分钟；

S4、向步骤S3得到的溶液中加入炎症靶向肽CBP，4℃搅拌过夜，使得CBP与白蛋白纳米粒充分的偶联；最后采用超滤管超滤纳米粒溶液，除去未结合的白蛋白、戊二醛、乙醇残留，得到TAP/pCas9-PAR2。

2.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S1中，构建eSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0质粒作为CRISPR的敲除质粒pCas9-PAR2。

3.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，所述质粒自带氨苄抗性的基因-AmpR、连接原核生物基因质粒的起始位点-Ori、启动子-U6、敲除PAR2的基因-F2RL1、Cas9核酸酶和表达嘌呤霉素抗性蛋白的PuroR。

4.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S2中，人血清白蛋白溶液中，人血清白蛋白浓度为10mg/mL。

5.如权利要求4所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S2中，聚乙烯亚胺溶液中，聚乙烯亚胺为分子量10k。

6.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S3中，乙醇溶液是体积浓度96％的乙醇溶液。

7.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S4中，使用膜孔大小为30kDa的超滤管超滤纳米粒溶液。