[发明专利]一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法

说明书

本发明公开了一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，主要步骤是：首先构建CRISPR‑Cas9质粒；然后将人血清白蛋白水溶液、聚乙烯亚胺溶液、pCas9/PAR2混合，控制聚乙烯亚胺的氮与质粒的磷酸盐的氮磷比为16:1，涡旋数十秒，静置数十分钟；在搅拌条件下，向混合溶液中加入乙醇溶液，继续搅拌30分钟，再加入戊二醛溶液，搅拌30分钟；再向溶液中加入炎症靶向肽CBP，4℃搅拌过夜，使得CBP与白蛋白纳米粒充分的偶联；最后采用超滤管超滤纳米粒溶液，除去未结合的白蛋白、戊二醛、乙醇残留，得到TAP/pCas9‑PAR2。本发明的方法不需要将白蛋白HSA修饰成阳离子材料，仍能将外源基因转染进入细胞；具有靶向递送的作用，达到高效、安全地敲除目的基因。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法。

背景技术

蛋白酶活化受体2(PAR2)属于G蛋白偶联受体(GPCRs)，可以被某些蛋白酶激活，调节下游炎症信号转导及功能。目前，PAR2激动剂较为成熟，但PAR2抑制剂还无法达到精准调控。因此，探索一些新的策略精准调控PAR2基因是十分必要的。

CRISPR-Cas9被称为第三代基因编辑技术，可通过精准定位基因组某一位点，剪断靶标DNA片段并插入、敲除或替换新的基因片段高效地改造基因。CRISPR的成功实现通常需要Cas9在一组细胞中引出有效的目标基因并敲除，研究发现CRISPR对目标基因的敲除高度依赖于sgRNA引导序列的效力。因此，CRISPR-Cas9系统可代替抑制剂实现PAR2基因的敲除，从而达到精准调控的作用。

目前研究表明，外源性基因在作为药物发挥作用时，必须先克服两大障碍。一是胞外屏障，是指递送载体在到达靶细胞的过程中，包括细胞吞噬系统，胞外基质、降解酶等的影响因素；二是胞内屏障，主要指的是细胞膜、内涵体、溶酶体以及核膜对靶基因进入核内有效表达的影响。正常情况下，在把外源基因导入靶细胞特别是进入细胞核，调控细胞内基因表达以实现基因插入、敲除或替换时，CRISPR等核酸大分子存在胞内稳定性差、摄取率低、易被核酸酶降解、体内外转染效率低等缺点。纳米粒是一类常见的药物载体，能保护和准确输送核酸药物至靶点，可作为CRISPR-Cas9的递送系统。目前很多研究采用阳离子材料如脂质体去包载基因药物，提高了转染效率，但阳离子材料对细胞具有较大的毒性，容易导致细胞死亡。

人血清白蛋白(HSA)是血液系统的重要组成部分，具有结合、运输物质、维持血液渗透压，清除自由基，抗凝血等功能。HSA除了具备可生物降解、无免疫原性、功能基团多、易修饰等特点，作为载体还具有以下有点：首先，作为一种天然的运载蛋白，HSA赋予药物载体较好的载药能力；其次，HSA具有天然的跨膜转运通路以及受体，可实现包载药物对病灶部位的靶向递送。目前HSA大多作为化药的运输载体，比如在紫杉醇、雷帕霉素等小分子药物。HSA本身是带负电的阴离子材料，在不被修饰成阳离子的情况下，很少包载同样电荷性质的基因药物如RNA、DNA等，更没有研究将其用在包载CRISPR-Cas9系统上。为了能够提高转染效率，利用人血清白蛋白基团多的特性，将其修饰成带正电荷的阳离子材料。将HSA修饰成阳离子材料后，虽能提高细胞转染效率，但具有一定毒性，从而诱导细胞死亡，若是运用在正常细胞上，反而会抑制细胞状态，导致实验失败。因此，研究一种既能提高转染效率和靶向性，又对正常细胞没有毒性的HSA基因药物载体，是势在必行的。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法。

本发明提供的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，步骤如下：

S1、构建CRISPR-Cas9质粒：

构建eSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0质粒作为CRISPR的敲除质粒pCas9-PAR2。