[发明专利]一种产糠胺的基因工程菌及其制备方法与应用

说明书

本发明一种产糠胺的基因工程菌及其制备方法与应用，本发明属于发酵工程技术领域。本发明为解决现有生物转氨催化制备糠胺存在氨基供体用量大、价格昂贵、需金属离子辅因子、辅底物用量大等问题。本发明方法：构建重组大肠杆菌细胞；将诱导表达的重组工程杆菌全细胞加入反应体系；回收全细胞催化剂，制备产品。利用廉价的无机氨基供体，同时利用葡萄糖为辅底物，制备糠胺；有效降低了氨基供体的用量与成本，同时大幅降低了葡萄糖用量，实现生物基糠胺的绿色高效合成。

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种产糠胺的基因工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

糠胺(2-Furfurylamine，FLA)，又名2-呋喃甲胺，分子式为C5H7NO，是一种无色油状液体，见光、受热或暴露在空气中会吸收CO2而变质，能溶于乙醇等。糠胺是衍生自糠醛的一种伯胺类化合物，在现代化学和工业中具有多种应用，包括聚合物、农药、生物活性分子的合成以及作为如杀菌剂、胆碱能药、降压药和利尿剂等药物合成的中间体。目前，糠胺主要合成方法以化学法为主，在高温高压的条件下，通过糠醛与液氮进行氢化反应制备，因产物结构特殊，对反应条件要求较为苛刻，后续研究主要围绕催化剂进行改进。目前，各种贵金属催化剂(镍金属，CN1704411A，糠胺产率85％；Ru金属，Research on ChemicalIntermediates，2015，42:19-30，糠胺产率60％)均已应用与合成糠胺，但现有的贵金属催化氢化法存在反应条件苛刻、催化剂成本高、收率低等问题，无法实现糠胺的绿色合成。

生物催化具有选择性高、催化效率高、反应条件温和的优势，例如2017年Alice等(Green Chem，2017，19:397-404)利用源自Chromobacteium violaceum(DSM30191)的转氨酶(CV-TAMs)催化糠醛制备糠胺，但目前的转氨反应的氨基供体多为丙氨酸、异丙胺及甲基苄胺等有机胺，其用量大、价格昂贵且部分具有生物致毒性。2021年李清等(Green Chem，2021，23:8154-8168)利用转氨酶(CV-TAMs)与丙氨酸脱氢酶(AlaDH)在氯化胆碱/乙二醇-水的两相体系下，利用氯化铵为氨基供体催化合成糠胺，但其级联催化体系存在需要采用氯化胆碱/乙二醇构建反应溶剂体系、金属离子辅因子，且需要大量的辅底物葡萄糖。

在此基础上针对现有生物转氨催化制备糠胺存在氨基供体用量大、价格昂贵、需金属离子辅因子、辅底物用量大的问题。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种利用重组大肠杆菌全细胞催化糠醛制备糠胺的绿色高效合成方法，利用廉价的无机氨基供体及葡萄糖制备糠胺，克服了现有生物转氨存在的氨基供体用量大、价格昂贵、需金属离子辅因子、辅底物用量大的问题。

本发明提供一种产糠胺的基因工程菌，所述基因工程菌过表达转氨酶基因OATA和丙氨酸脱氢酶基因ALD。

进一步地限定，所述基因工程菌被敲除DNA结合转录双调节因子arcA，并过表达转氨酶基因OATA、丙氨酸脱氢酶基因ALD和T7启动子连接碳存储调节因子CsrB基因。

进一步地限定，所述转氨酶基因OATA，来源于人苍白杆菌，基因序列如SEQ IDNO.3所示；所述丙氨酸脱氢酶基因ALD，来源于来源于谷草芽孢杆菌，Genebank ID：936557；csrB基因序列如SEQ ID NO.1所示；DNA结合转录双调节因子arcA的GeneBank ID为QJZ27444.1。

进一步地限定，上述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

本发明提供上述的基因工程菌的微生物制剂。

本发明提供一种上述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：