[发明专利]一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法

权利要求书

1.一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)酶溶液配制：在无菌双蒸水中加入甘露醇、KCl和MES缓冲液，进行第一水浴保温，然后加入纤维素酶R10、离析酶R10，进行第二水浴保温，然后冰浴，使溶液温度降为室温，再向溶液中加入CaCl₂、BSA、β-巯基乙醇，混匀后依次进行过滤、真空渗透，去除气泡，得酶溶液；

(2)酶解：将簸箕柳叶片沿垂直叶脉方向切成叶条，浸泡于步骤(1)所得酶溶液中，真空渗透25～35min，然后室温避光，酶解3.5～4.5h；

(3)W5溶液配制：在无菌双蒸水中加入NaCl、CaCl₂、KCl和MES缓冲液，混匀得W5溶液；

(4)MMG溶液配制：在无菌双蒸水中加入甘露醇、MgCl₂和MES缓冲液，混匀得MMG溶液；

(5)将步骤(2)酶解完成的簸箕柳叶片与等体积的W5溶液混合，得混合液；

(6)对所得混合液进行过滤、离心，吸掉上清液，沉淀部分即为原生质体；

(7)加入W5溶液重悬原生质体，冰浴25～35min，原生质体沉淀到底部，吸掉上清，将沉淀重悬于MMG溶液中，得簸箕柳叶肉原生质体悬浮液。

2.根据权利要求1所述的一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，步骤(1)中所述甘露醇的浓度为0.3～0.5M，所述KCl的浓度为15～25mM，所述MES缓冲液的浓度为15～25mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6，所述第一水浴保温的温度为50～60℃，所述第一水浴保温的时间为4～6min，所述纤维素酶R10的浓度为10～20g/L，所述离析酶R10的浓度为3～5g/L，所述第二水浴保温的温度为50～60℃，所述第二水浴保温的时间为8～12min，所述CaCl₂的浓度为8～12mM，所述BSA的浓度为0.05～0.15wt％，所述β-巯基乙醇的浓度为4～6mM，所述过滤的孔径为0.2～0.4mm，所述真空渗透的时间为10～20min。

3.根据权利要求1所述的一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，步骤(2)中所述簸箕柳叶片的来源为簸箕柳容器苗或簸箕柳组培苗，所述叶条的宽度为0.5～1mm，所述叶条与酶溶液的用量比为0.5～1.5g:100mL，所述酶解在摇动条件下进行，所述摇动的转速为45～55rpm。

4.根据权利要求1所述的一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，步骤(3)中所述NaCl的浓度为150～155mM，所述CaCl₂的浓度为120～130mM，所述KCl的浓度为4～6mM，所述MES缓冲液的浓度为1～3mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6；

步骤(4)中所述甘露醇的浓度为0.3～0.5M，所述MgCl₂的浓度为10～20mM，所述MES缓冲液的浓度为3～5mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6。

5.根据权利要求1所述的一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，其特征在于，步骤(6)中所述过滤采用细胞筛网进行，所述细胞筛网的孔径为65～75μm，所述离心的转速为80×g～120×g，所述离心的时间为1～3min；

步骤(7)中所述W5溶液的用量为0.8～1.2mL，所述MMG溶液的用量为0.8～1.2mL。

6.权利要求1～5任意一项所述游离方法得到的簸箕柳叶肉原生质体悬浮液。