[发明专利]一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，本发明提供了一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法。本发明以簸箕柳组培苗及容器苗叶片为材料，利用酶解法(纤维素酶R10和离析酶R10)游离叶肉原生质体，然后利用聚乙二醇(PEG)法将载体p2GWF7导入得到的簸箕柳叶肉原生质体中，建立簸箕柳原生质体瞬时表达体系。利用本发明方法最终得到的原生质体的产量高达1.57×10⁷个/gFW，且原生质体转化效率达74.3％。本发明为高通量开展簸箕柳关键基因的功能研究与利用提供了有力工具。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法。

背景技术

簸箕柳(Salixsuchowensis)隶属于杨柳科柳属，是原产于中国的小灌木，与木本植物模式物种-杨树是姊妹属。但与杨树相比，簸箕柳幼龄期短，一般杂交当年即可开花，而且植株矮小，可以进行大规模的田间实验，是进行木本植物遗传学研究的理想材料。随着簸箕柳全基因组测序、组装的完成，该树种有望成为新一代木本植物模式物种。但簸箕柳高效、稳定的遗传转化体系尚未建立，制约了其功能基因组学的研究。原生质体经过处理可以摄取病毒、质粒、DNA等各种大分子，是进行遗传转化的理想受体材料，广泛应用于植物分子生物学与基因工程研究。为此，有必要提出一种簸箕柳叶肉原生质体游离及瞬时表达体系建立的方法，为高通量开展簸箕柳关键基因的功能研究与利用提供有力工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法及瞬时表达体系的建立方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种簸箕柳叶肉原生质体游离方法，包括如下步骤：

(1)酶溶液配制：在无菌双蒸水中加入甘露醇、KCl和MES缓冲液，进行第一水浴保温，然后加入纤维素酶R10、离析酶R10，进行第二水浴保温，然后冰浴，使溶液温度降为室温，再向溶液中加入CaCl₂、BSA、β-巯基乙醇，混匀后依次进行过滤、真空渗透，去除气泡，得酶溶液；

(2)酶解：将簸箕柳叶片沿垂直叶脉方向切成叶条，浸泡于步骤(1)所得酶溶液中，真空渗透25～35min，然后室温避光，酶解3.5～4.5h；

(3)W5溶液配制：在无菌双蒸水中加入NaCl、CaCl₂、KCl和MES缓冲液，混匀得W5溶液；

(4)MMG溶液配制：在无菌双蒸水中加入甘露醇、MgCl₂和MES缓冲液，混匀得MMG溶液；

(5)将步骤(2)酶解完成的簸箕柳叶片与等体积的W5溶液混合，得混合液；

(6)对所得混合液进行过滤、离心，吸掉上清液，沉淀部分即为原生质体；

(7)加入W5溶液重悬原生质体，冰浴25～35min，原生质体沉淀到底部，吸掉上清，将沉淀重悬于MMG溶液中，得簸箕柳叶肉原生质体悬浮液。

优选的，步骤(1)中所述甘露醇的浓度为0.3～0.5M，所述KCl的浓度为15～25mM，所述MES缓冲液的浓度为15～25mM，所述MES缓冲液的pH值为5～6，所述第一水浴保温的温度为50～60℃，所述第一水浴保温的时间为4～6min，所述纤维素酶R10的浓度为10～20g/L，所述离析酶R10的浓度为3～5g/L，所述第二水浴保温的温度为50～60℃，所述第二水浴保温的时间为8～12min，所述CaCl₂的浓度为8～12mM，所述BSA的浓度为0.05～0.15wt％，所述β-巯基乙醇的浓度为4～6mM，所述过滤的孔径为0.2～0.4mm，所述真空渗透的时间为10～20min。