[发明专利]一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法

说明书

本发明提供了一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法。本发明在一链cDNA合成后，提供了一种夹板接头，该接头具有互补的双链DNA结构且末端突出包含有6个兼并碱基，可以与逆转录产物一链cDNA的3'端以粘性方式进行高效连接。连接产物通过USER酶的处理会使夹板接头的双链结构打开，从而可以通过PCR技术对cDNA进行高效扩增而得到测序文库。本发明提供的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，可以显著的提高对低丰度RNA的检测，缩减文库构建的时间。本发明可以使小RNA的文库构建不再依赖于RNA‑RNA间的连接，或者仅需针对RNA的3'端进行RNA接头连接。

技术领域

本发明涉及生物技术以及分子生物学领域，尤其涉及一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法。

背景技术

随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究工作着重于RNA表达的分析。RNA的高通量测序已经成为一种常用手段。普通转录组的文库构建已经被广泛使用来研究mRNA基因的功能以及作用机制。但是对于短片段的小RNA，目前仍未有较为便捷的测序文库构建方法。现有技术中常用的小RNA文库构建的方法，首先主要依赖于利用RNA连接酶进行小RNA的5'端和3'端的RNA接头连接，而该种基于RNA-RNA连接的建库方式不仅连接效率低，且易导致RNA降解，通常仅能对表达丰度较高的部分RNA实现文库的构建。而且当前常用的方法需要经过多个繁琐的步骤。例如，NEBNext small RNA preparation kit需要对分离得到的小RNA进行5'端和3'端测序接头的连接，随后通过接头上已知序列进行逆转录得到一链cDNA，依赖于cDNA两端特异性序列进行PCR扩增得到高通量测序文库，最终进行测序鉴定各类小RNA的表达丰度和变化情况。

然而，通常情况下小RNA的表达丰度较低，因此大多数低丰度的RNA无法完成逆转录而形成测序文库。此外，基于RNA与RNA连接的方法，通常会采用过量的接头，从而导致连接体系中残留较多的接头，最终会使构建所得的文库质量大幅下降。因而，该传统方法并不适用于低丰度RNA建库。不仅如此，其操作繁琐，需要超过12个小时的连续实验操作，才能从RNA得到文库用于高通量测序。

因此，现有技术还有待改进。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，旨在解决现有技术中小RNA文库构建需要经过多个繁琐的步骤且依赖于效率较低的RNA-RNA连接的问题。

本发明的技术方案如下：

一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，包括步骤：

提供S6引物和S7引物，通过所述S6引物和S7引物退火形成夹板接头；

将待测的小RNA进行逆转录，获得一链cDNA；

将所述一链cDNA进行变性；

将变性后的一链cDNA与所述夹板接头混合于连接体系中进行反应，得到连接产物；

利用USER酶对所述连接产物进行消化，得到特定接头序列cDNA；

将所述特定接头序列cDNA与S4引物以及S19引物混合于扩增体系中进行反应，得到所述的小RNA高通量测序文库。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，所述夹板接头具有双链DNA结构且末端突出6个兼并碱基。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，所述S6引物的序列为：

CACCTCTCTAUACACUCTTUCCCUACACGACGCTCTUCCGATCUNNN NNN-invT；所述S7引物的序列为：