[发明专利]采用盐单胞菌株生产四氢嘧啶的方法

说明书

本发明提供了一种采用盐单胞菌株Halomonas sp. YL01发酵生产四氢嘧啶的方法，以该菌株为发酵菌菌株，将乙酸盐作为主碳源，通过对培养基及发酵条件的优化，可实现四氢嘧啶的工业化发酵生产。通过替代传统葡萄糖作为碳源，该发酵方法大幅降低生产四氢嘧啶的成本。

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种全新的生产四氢嘧啶用盐单胞菌株及采用该菌生产四氢嘧啶的方法。

背景技术

四氢嘧啶(ectoine，Ect)及其衍生物羟基四氢嘧啶(hydroxyectoine，5-Hect)最初是从嗜盐和耐盐微生物中发现的一类重要的相容性溶质 (compatible solutes)。四氢嘧啶可以帮助嗜盐和耐盐微生物适应高盐、高渗透压和紫外辐射等环境，维持其在逆境中的正常生长。四氢嘧啶可以增强细胞在多种逆境(如高盐、热、干燥和冷冻等)中的耐受性，因此在生物保护、生物医药以及生物科技等领域都展现出广阔的应用前景。伴随着四氢嘧啶商业化应用的快速发展，四氢嘧啶的微生物合成研究一直是四氢嘧啶研究的重点和热点。

现有四氢嘧啶生物合成主要有以下四种方法，第一种是利用野生菌株合成四氢嘧啶。野生菌株在高盐环境中可以快速生成四氢嘧啶以维持细胞渗透压的平衡，当细胞处于低盐环境中，细胞可感知渗透压的变化并将四氢嘧啶释放至胞外，保持细胞渗透压平衡。将细胞在高盐及低盐环境中反复循环，细胞可持续对外生成四氢嘧啶。这种生产方式被形象的称为“细菌挤奶”。

第二种是筛选天然可在低盐环境中合成四氢嘧啶的菌株，利用天然菌株在低盐环境中可生产四氢嘧啶并分泌到胞外特性，实现四氢嘧啶的连续生产。

第三种是利用合成生物学手段进行四氢嘧啶的异源合成，将四氢嘧啶合成基因簇ectABC转入大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等异源菌种。异源合成优势在于异源菌种中不存在四氢嘧啶的降解通路，不需对降解通路相关基因进行敲除即可实现四氢嘧啶的高产。

第四种是利用合成生物学手段改造嗜盐微生物提升四氢嘧啶产量。主要是通过提升四氢嘧啶合成通路基因的表达及敲除四氢嘧啶降解相关基因来提升四氢嘧啶的产量。

以上四种常用的发酵方式基本上采用葡萄糖为主要碳源进行发酵，少量利用谷氨酸盐、甘油和L-天门冬氨酸等作为发酵碳源。谷氨酸盐、甘油及L-天门冬氨酸价格高昂，在发酵中往往作为辅助材料，以这些为主要碳源生产成本较高，无法实现大规模的产业化应用。

葡萄糖主要来源是淀粉，而淀粉是重要的粮食资源。因此寻找一种以非葡萄糖为主要碳源的微生物发酵产四氢嘧啶是现阶段行业亟需解决的问题。

北京化工大学生命学院谭天伟院士研究团队和软物质高精尖中心兼职教授延斯尼尔森院士研究团队在 Nature Catalysis 刊文，提出了第三代生物炼制的概念，旨在利用微生物细胞工厂将可再生能源和二氧化碳转化为燃料和化学品。与传统生物炼制路线相比，第三代生物炼制更加环保，环境友好性高，且可以极大的降低原料加工成本。

短链脂肪酸如丙酸、乙酸等来源广泛，可被微生物利用厨余垃圾、高浓度有机废水、城市垃圾等发酵生产。同时也存在电催化产乙酸，可利用电催化技术将二氧化碳转化为丙酸、乙酸，不仅解决了二氧化碳排放问题，同时生成可利用的生物碳源，助力碳减排碳中和。因此利用丙酸、乙酸等为碳源发酵生产四氢嘧啶不仅能解决利用葡萄糖发酵带来的一系列问题，同时能为碳中和碳减排贡献部分力量。

本申请发明人在进行盐湖淤泥采样后获得一株高产四氢嘧啶的盐单胞菌 Halomonassp. YL01，对其进行宏基因组测序及代谢通路分析表明，其可利用乙酸为唯一碳源进行代谢，且具有较高的乙酸盐耐受度。进一步通过研究发现，盐单胞菌 Halomonassp.YL01可利用以乙酸盐、丙酸盐或者两者构成的混合碳源生产四氢嘧啶。