[发明专利]一种具有强扩增能力的间充质干细胞的筛选方法

说明书

本发明提供了一种具有强扩增能力的间充质干细胞的筛选方法，所述筛选方法包括依次进行的初步筛选和极限传代筛选。本发明提供的方法通过利用初步筛选和极限传代筛选的组合型筛选方式，能够优选出各项检测指标合格、高增殖能力的骨髓间充质干细胞，以作为原代间充质干细胞库。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及高扩增能力间充质干细胞的筛选方法。

背景技术

近年来，间充质干细胞的临床价值已被广泛证明。我国2019年12月生效的新的《药品管理法》中明确细胞治疗产品属于生物制品，需要按照药品监管。

干细胞的扩增能力是指从单一供者的原始来源组织，经过特定工艺，扩增到临床使用代次时，能够获得更多细胞数量的能力。受工艺规模限制，在很多情况下，干细胞生产工艺需要对细胞系进行多级建库，干细胞的最大扩增能力需要很多批生产才能实现，因此，干细胞的扩增能力可以根据各级细胞库中的细胞数量和单批产量进行理论计算。干细胞的扩增能力，是评价干细胞扩增技术优劣的核心指标之一。

受到遗传学和表观遗传学等多种因素影响，不同供者来源的骨髓间充质干细胞在扩增能力方面有极大差异。显而易见的，在保证细胞质量的前提下，扩增能力越强的细胞系，可以生产出的终产品就越多，这对于控制细胞筛选的成本有极大好处。而且，干细胞临床试验期间需要样品数量很多，扩增能力强的细胞系，可以保证在临床期间使用样品来源一致，排除掉干细胞产品由于供者来源不同造成的质量差异，有利于获得真实的临床结果。因此，干细胞药物开发企业需要对多个不同供者来源的细胞系进行筛选，以识别出高扩增能力的细胞系。

目前我国已经发布了一系列指南和行业标准，如《干细胞制剂质量控制指导原则》和《细胞治疗产品生产质量管理指南》等，对干细胞制剂的质量控制都有明确的规定，包括对干细胞的采集、分离及干细胞(系)的建立，和对干细胞制剂的制备、检验和质量研究都有详细的要求。这些质量标准集中在确认间充质干细胞产品的安全性，但对于间充质干细胞的扩增能力的强弱，仍无明确的筛选方法指导和鉴定指标。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明旨在建立一种强扩增能力干细胞的筛选方法，其用于对不同供者来源的干细胞、特别是骨髓间充质干细胞进行筛选，在保证细胞质量的前提下，筛选出扩增能力强的细胞系进入生产。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供一种具有强扩增能力的间充质干细胞的筛选方法，所述筛选方法包括依次进行的初步筛选和极限传代筛选，其中：

所述初步筛选包括以下步骤：

(1)获得多个P0(第0代)间充质干细胞样品(作为母细胞库)；

(2)将步骤(1)中的P0间充质干细胞扩增至P4(第4代)间充质干细胞(作为终产品)；

(3)筛选从P0至P4的细胞群倍加数(PDL)≥25的P4间充质干细胞：

所述极限传代筛选包括以下步骤：

(1)将初步筛选合格的P4间充质干细胞扩增至P10间充质干细胞；

(2)筛选同时满足以下标准的P10间充质干细胞：

a.从P0至P10的PDL≥45；

b.从P4至P10的任意代次倍增时间≤60h；

c.每100个细胞成克隆数≥10个；

由此获得具有强扩增能力的间充质干细胞。

优选地，所述间充质干细胞样品为人骨髓、脐带、胎盘、脂肪或牙髓等组织来源的间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞样品为不同供者来源。优选地，所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞(hBMMSC)。