[发明专利]水产品中沃尼妙林、泰妙菌素及其代谢物残留量的定量检测方法

权利要求书

1.一种同位素稀释高效液相色谱-串联质谱测定水产品中沃尼妙林、泰妙菌素及其代谢物残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、样品提取：取匀质的带皮肌肉样品或肌肉样品，于具塞离心管中，加沃尼妙林-D₆和泰妙菌素-¹³C₄的混合内标工作液，加入乙腈含1％乙酸，涡旋混合，超声提取，再加入无水硫酸镁和氯化钠，涡旋混合后离心，取上清液备用，残渣加入乙腈含1％乙酸重复提取一次，合并上清液，旋转蒸发至干，加入2％乙酸溶液溶解残留物，转移溶液至具塞离心管，加入正己烷，涡旋振荡后离心，弃去上层正己烷；

B、水解：在上述提取液中加入氢氧化钠溶液，混匀，再加入盐酸，混匀后加入乙酸乙酯含1％乙酸，涡旋振荡后离心，取上清液至离心管中，残渣加入乙酸乙酯含1％乙酸重复提取一次，合并上清液至离心管中，氮气吹干，加入30％乙腈溶液，涡旋振荡后离心，取上清液，经孔径不大于0.22μm的滤膜过滤，滤液供液相色谱-串联质谱测定；

C、HPLC分析条件：色谱柱：C18，长100mm×直径2.1mm，粒径3μm；柱温：40℃；流速：0.4mL/min；进样量：20μL；流动相：有机相为0.1％氨化乙腈，水相为0.1％氨水溶液；梯度洗脱程序：0～0.1min 20％的有机相，0.1～5.0min内线性增加到体积浓度为90％的有机相，5.0～6.5min内线性降低到体积浓度为20％的有机相，最后维持3.5min，进样体积为20μL；

D、HESI-MS/MS分析条件：加热电喷雾离子源，正离子模式和负离子模式切换；检测方式采用选择反应监测模式；正离子模式喷雾电压：3500V，负离子模式喷雾电压：-3000v；质谱蒸发气温度：300℃；鞘气压力50arb；辅助气压力15arb；碰撞气及压力：氩气纯度≥99.999，1.5m Torr；离子传输毛细管温度：350℃；Q1的半峰宽设为0.7，Q3的半峰宽设为0.7；离子源：加热电喷雾离子源HESI；扫描方式：正离子扫描、负离子扫描；喷雾电压：正离子模式3500V，负离子模式-3000V；蒸发气温度：270℃；鞘气流速：6L/min；辅助气流速：15L/min；离子传输管温度：350℃；碰撞气及压力：氩气，1.5mTorr，检测参数具体如下：

E、基质匹配标准曲线法定量：沃尼妙林、泰妙菌素采用内标法建立基质匹配标准曲线，8-α-羟基妙林采用外标法建立基质匹配标准曲线，并据此计算样品中沃尼妙林、泰妙菌素及8-α-羟基妙林的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基质匹配标准曲线法定量包括以下步骤：

(1)基质匹配标准曲线的建立：空白样品经步骤A所述提取处理和步骤B所述水解处理后，加入8-α-羟基妙林标准工作液、沃尼妙林和泰妙菌素混合标准工作液以及沃尼妙林-D₆、泰妙菌素-¹³C₄混合内标工作液，按照步骤C和D所述条件进行HPLC-HESI-MS/MS测定；以测得的8-α-羟基妙林特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，8-α-羟基妙林的标准工作液浓度为横坐标，绘制8-α-羟基妙林的基质匹配标准曲线；以沃尼妙林与沃尼妙林-D₆的特征离子质量色谱峰面积比值为纵坐标，沃尼妙林标准工作液的浓度为横坐标，绘制沃尼妙林的基质匹配标准曲线；以泰妙菌素与泰妙菌素-¹³C₄的特征离子质量色谱峰面积比值为纵坐标，泰妙菌素标准工作液浓度为横坐标，绘制泰妙菌素的基质匹配标准曲线；

(2)水产品中沃尼妙林、泰妙菌素、8-α-羟基妙林残留量的计算方法：通过HPLC-HESI-MS/MS测定的样品中沃尼妙林和内标沃尼妙林-D₆定量离子峰面积的比值代入沃尼妙林基质匹配标准曲线，计算出沃尼妙林的残留量；将HPLC-HESI-MS/MS测定的样品中泰妙菌素和内标泰妙菌素-¹³C₄定量离子的峰面积比值代入泰妙菌素基质匹配标准曲线，计算出泰妙菌素的残留量；通过HPLC-HESI-MS/MS测定的样品中8-α-羟基妙林定量离子峰面积的值代入8-α-羟基妙林基质匹配标准曲线，计算出8-α-羟基妙林的残留量。