[发明专利]一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法

说明书

本发明提供一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法，所述酮基还原酶突变体为发生了氨基酸突变的酮基还原酶，所述酮基还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变的类型包括D77S、P195Y、D207F、D77S/P195Y、P195Y/D207F、D77S/D207F或D77S/P195Y/D207F。本发明的酮基还原酶突变体与原始酮基还原酶相比，酶活得到明显增强，酶促反应所需时间大大缩短，提高了反应特异性，转化率和产物的光学纯度大幅提升，且酶的底物耐受能力更高，能够在高浓度底物水平下进行反应，实现了奥卡西平向艾司利卡西平的高效转化，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于蛋白改造技术领域，尤其涉及一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法。

背景技术

艾司利卡西平(S-利卡西平，(S)-10-hydroxy-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]axepine-5-carboxamide)是一种新型的抗癫痫药物，可阻断电压门控钠通道活性，抑制脑部神经的异常放电，是醋酸艾司利卡西平(商品名Aptiom)的前体物，也是现有治疗药物奥卡西平在体内的主要活性代谢产物。

奥卡西平在体内可代谢为S-利卡西平和R-立卡西平两种异构体，其中S-异构体比R-利卡西平的不良反应更轻微，且治疗效果更好，S-利卡西平可以更有效地穿过血脑屏障。因此，后续开发出可有效释放S-利卡西平的艾司利卡西平醋酸酯前体药物，它可以在消化道中被有效吸收，并水解作用代谢为S-利卡西平，与奥卡西平相比其机体耐受性更好。

现有文献报道的艾司利卡西平的制备方法主要分为两类，一类是化学催化法，其是使用各类催化物及氢供体还原生成艾司利卡西平，但反应过程中常常需要使用到一些昂贵的催化试剂，整体成本较高，反应路线长，最终产品难以保证较高的收率；另外，反应过程中使用的多种有机试剂，造成后处理困难，难以实现大规模的生产。而另外一类则是生物催化法，多使用全细胞或者胞内酶还原奥卡西平以获得艾司利卡西平。CN102465159A公开了以奥卡西平为底物，以酿酒酵母发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，进行生物转化反应制得艾利西平。CN107475211A公开了使用一株炭疽芽孢杆菌bacillus anthracis获得羰基还原酶，并通过构建两相反应体系，在油/水两相体系进行催化反应将奥卡西平转化为艾司利卡西平。生物催化法制备艾司利卡西平具有转化效率高、反应专一性强、成本低廉等优势，在未来必会有巨大的生产应用前景。但现有的酮基还原酶存在反应活性及专一性较差，对底物的耐受力差，反应效率低，所获得的产物存在较多的异构体成分难以去除等问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法，为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种酮基还原酶突变体，所述酮基还原酶突变体为发生了氨基酸突变的酮基还原酶，所述酮基还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变的类型包括D77S、P195Y、D207F、D77S/P195Y、P195Y/D207F、D77S/D207F或D77S/P195Y/D207F。

SEQ ID NO:1：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSDFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAPLTPFKVRAGPVDEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。