[发明专利]一种具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法及其特异性引物探针组合

权利要求书

1.一种检测PEDV的荧光PCR方法的特异性引物探针组合，其特征在于，包括：

PEDV上游引物：5’-AAGAACAAATCCAGGGCCA-3’；

PEDV下游引物：5’-TAAACTGGCGATCTGAGCATA-3’；

PEDV探针：FAM-AAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTC-BHQ1；

IPC上游引物：5’-TGCTCGGTGCCTTTAGTGAT-3’；

IPC下游引物：5’-AGTCCCATAGACTCACCCTGAA-3’；

IPC探针：VIC-TGGCTCACCTGGACAACCTCAAGG-TAMRA；其序列分别如SEQ IDNO：1-6所示。

2.采用权利要求1所述特异性引物探针组合的具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)模板RNA的提取；

(2)双重荧光定量反应体系配置：在200μl PCR管配制反应体系：含UNG酶的一步法荧光PCR反应液10μl，PEDV上游引物、PEDV下游引物、PEDV探针各0.8μl，IPC上游引物、IPC下游引物、IPC探针各0.4μl，ddH₂O 1μl进行配制；将上述反应液进行预混，分装15μl，加入模板RNA5μl，然后进行上机操作

(3)PCR反应；

(4)质量控制

①对照设立：

阳性对照：已知的病原阳性样品制备的DNA模板；

阴性提取对照：使用纯净的无菌无酶水；

阴性无模板对照：使用纯净的无菌无酶水；

②IPC添加

在样品加入前，在每个提取孔中加入5μL IPC，从核酸提取到荧光PCR全程监控实验过程；

(5)实验成立条件：

阴性对照：FAM通道无Ct值或无典型的S型扩增曲线；

阴性提取对照：FAM通道无Ct值或无典型的S型扩增曲线，且IPC的CT值在预设值±3个CT值范围内；所述预设值为IPC制作过程完成后的实际测定值；

阳性对照：FAM通道Ct值≤35，扩增曲线为典型的S型扩增曲线；

同时满足以上三点，实验成立，否则结果不成立，实验结果无效；

(6)实验结果判定：

阴性结果：样品的IPC值在阴性提取对照IPC值±3个CT值范围内，无Ct值并且无典型的S型扩增曲线，表明样品中不存在所检测的病原核酸；

阳性结果：Ct值≤35，且出现典型的S型扩增曲线，表明样品中存在所检测的病原核酸；

可疑结果：Ct值＞35的样本，需重复实验；重复实验结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

需重复检测结果：样品的IPC值在阴性提取对照IPC值±3个CT值范围以外，无Ct值并且无典型的S型扩增曲线，说明样本中可能存在反应抑制或提取失败。

3.根据权利要求2所述的具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，提取待检样品的RNA，同时在提取板中加入内部阳性质控品IPC 5μl参与整个核酸提取过程，对核酸提取及后续的PCR反应进行监控，提取后的核酸用于后续的PCR扩增反应。

4.根据权利要求3所述的具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤(3)PCR反应程序为，

UNG酶防污染：25℃10min；1Cycle；

反转录：52℃5min；1Cycle。

预变性：95℃10s；1Cycle；

PCR反应：95℃5sec；60℃30s；40Cycles。