[发明专利]一种具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法及其特异性引物探针组合

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是一种具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法及其特异性引物探针组合，其中特异性引物包括PEDV上、下游引物及PEDV探针，IPC上、下游引物及IPC探针，序列分别如SEQ ID NO：1‑6所示。基于上述引物及探针，本发明的荧光PCR方法包括如下步骤：1)模板RNA的提取；2)双重荧光定量反应体系配置；3)PCR反应；4)质量控制；5)实验成立条件及实验结果判定。本发明方法可以监控样本中由于存在PCR反应抑制剂时出现的假阴性，同时拥有完整的质控体系，对PCR检测流程进行监控，能在较短时间内诊断出流行性腹泻病毒感染情况；灵敏度高，最低可检测出1copy/μl。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体领域为一种检测PEDV的荧光PCR方法。

背景技术

近年来，猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)引起的猪流行性腹泻(Porcine epidemicdiarrhea，PED)暴发和流行已给我国乃至全球的养猪业造成毁灭性的打击。2013～2015年猪流行性腹泻病的暴发导致美国养猪业每年损失9亿～18亿美元，韩国约40％的种猪场受到影响，损失惨重。新型猪流行性腹泻病毒毒株已成为造成猪群发生群体性腹泻疾病中最为重要的因素之一。

2021年，内蒙古自治区畜牧业生产呈现以下特点：一是生猪生产加快恢复，生猪存栏、出栏头数较快增长，2021年末，内蒙古自治区生猪存栏565.2万头，比上年增长5.8％，出栏812.9万头，比上年增长9.5％。就此情况看，内蒙古自治区生猪呈现逐年增加的良好势头，猪腹泻作为生猪养殖最常见疾病被中国动物疫病防控中心纳入《生猪常见疫病防控技术指南》中。

目前，国家标准针对猪流行性腹泻病毒的检测方法主要以普通的RT-PCR检测方法及单重病原的荧光定量诊断方法为主，缺少完整的质控体系，缺乏对PCR整个流程的监控，包括对核酸提取试剂、人员操作、设备及样本中是否存在抑制物等进行监控。

因此，开发一种具有质控体系的检测PEDV的方法成为了本领域亟需解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有质控体系的检测PEDV的荧光PCR方法及其特异性引物探针组合。

本发明根据GenBank中已发表的“猪流行性腹泻病毒”(PEDV)(登录号：MH726401.1)及人源HBB基因(登录号：MK476504.1)主要代表病毒株序列进行分析，分别用PEDV保守的N基因和人源的HBB基因作为靶基因，利用Primer Express 3.0.1软件设计了1对PEDV特异性引物探针及内部阳性质控品(IPC)特异性的引物探针，2组由不同荧光基团标记的特异性探针(PEDV用FAM基团修饰、IPC用VIC基团修饰)。根据设计合成的两组引物探针进行双重荧光PCR方法建立，同时引入防污染酶等技术，建立了拥有完整质控体系的流行性腹泻病毒(PEDV)荧光检测方法。

具体而言，本发明提供如下技术方案：

一种检测PEDV的荧光PCR方法的特异性引物探针组合，包括：

PEDV上游引物：5’-AAGAACAAATCCAGGGCCA-3’；

PEDV下游引物：5’-TAAACTGGCGATCTGAGCATA-3’；

PEDV探针：FAM-AAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTC-BHQ1；

IPC上游引物：5’-TGCTCGGTGCCTTTAGTGAT-3’；

IPC下游引物：5’-AGTCCCATAGACTCACCCTGAA-3’；

IPC探针：VIC-TGGCTCACCTGGACAACCTCAAGG-TAMRA；其序列分别如SEQ IDNO：1-6所示。