[发明专利]一种双途径合成壳寡糖的全细胞及其生产方法

说明书

本发明公开了一种双途径合成壳寡糖的全细胞及其生产方法，属于合成生物学领域和生物医药领域。本发明通过过表达N‑乙酰氨基葡萄糖转运蛋白、N‑乙酰氨基葡萄糖激酶、磷酸化N‑乙酰氨基葡萄糖变位酶、几丁质合成酶、脱乙酰基酶五种酶蛋白，并结合胞内已知的UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖的合成途径，组合构建了以葡萄糖和N‑乙酰氨基葡萄糖为前体的双途径合成壳寡糖的全细胞。本发明的全细胞，可以生产聚合度可控(DP10)、分子量均一(～1000Da)的壳寡糖。本发明采用全细胞生产的壳寡糖，最终获得胞外壳寡糖的含量可达20g/L，纯度较高，对于下游提取工艺降低了成本，同时全细胞生产方法具有过程简单、周期短、产量高等优势，工业化生产潜力明显。

技术领域

本发明涉及一种双途径合成壳寡糖的全细胞及其生产方法，属于合成生物学领域和生物医药领域。

背景技术

壳寡糖一般是指2～10个氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接组成的相对分子质量壳聚糖。近年来，由于壳寡糖具有各种各样的生物活性，引起了人们的广泛关注。与壳聚糖相比，壳寡糖具有低粘度、高水溶性、生物相容性和可生物降解性等理化特征。到目前为止，壳寡糖在食品、人类健康、畜牧业和农业等研究领域得到了广泛的研究。特别是通过修饰得到的壳寡糖衍生物，由于其高效的传递效率，在药物开发领域具有巨大的潜力。

在过去的研究中，壳寡糖的制备主要通过壳聚糖降解获得，主要方法有化学法、酶解法和物理法等。化学法在酸解过程中，聚合度不容易控制且产量较低，还会造成严重的环境污染。采用物理法制备壳寡糖操作比较简单，但是效果比较差。另外，酶解法虽然反应条件比较温和，但是过程繁琐，成本较高，原材料成本较高。

研究发现，微生物细胞中存在以N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和UDP-GlcNAc为前体，以几丁质合成酶NodC为催化剂的合成壳寡糖的生物合成途径。但是通常情况下，胞内UDP-GlcNAc和GlcNAc的浓度均不高，壳寡糖在单一细胞中的合成途径单一，无法满足工业化生产的需求。而且，目前尚未见基于多条途径合成壳寡糖的全细胞从头合成催化体系。

在前期研究过程中，本发明的发明人团队还开发了一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法(CN114990174A)，所述催化体系包含来源于Pseudomonasaeruginosa ATCC 15692的N-乙酰氨基葡萄糖激酶(AmgK)、来源于EscherichiacoliMG1655的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(GlmU)、来源于Azorhizobium caulinodansORS571的几丁质合成酶(NodC)和脱乙酰基酶(NodB)催化底物合成壳寡糖；该发明以大肠杆菌为底盘菌，通过自身相关基因的强启动子替换、重组质粒的快速构建与导入，获得拥有完整的壳寡糖从头合成途径的重组大肠杆菌，获得了具有从头合成壳寡糖途径的全细胞，可在优化后的催化体系中高效聚合葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为聚合度可控(DP10)、分子量均一(～1000Da)的壳寡糖，在5L发酵罐体系中壳聚糖产量可达23.2g/L，在1000L发酵罐体系中壳聚糖产量达到20g/L以上。但是，该发明所采用的体外多酶催化体系生产成本很高，不利于工业生产；全细胞生产的壳寡糖也大多积聚在胞内，对于下游提取工艺提出了挑战。

目前，也有一些在枯草芽孢杆菌实现壳寡糖生产的报道。比如，有研究通过补偿途径的添加，在枯草芽孢杆菌中，壳寡糖的产量可达4.82g/L；但是该重组菌壳寡糖产量低，补偿途径冗杂(Ling,et al.2022,Metabolic Enginering)。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过加强底物GlcNAc向细胞中的转运和缩短中间代谢路径，在枯草芽孢杆菌及酵母菌中构建新的代谢途径，实现了壳寡糖的胞外大量合成。本发明采用数据库挖掘的方式，获得了一系列酶元件，组装获得一条完整的微生物胞内合成壳寡糖的新途径。实现了该途径在工程菌株中的合理组装，从而获得了以葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为前体的双途径合成壳寡糖的全细胞转化方法。本发明的目的在于提供一种壳寡糖合成的新途径设计、全细胞转化的基因工程菌构建方法及壳寡糖的全细胞转化方法。