[发明专利]一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法在审

专利信息
申请号: 202211679381.1 申请日: 2022-12-26
公开(公告)号: CN115976654A 公开(公告)日: 2023-04-18
发明(设计)人: 刘增玮 申请(专利权)人: 苏州璞瑞卓越生物科技有限公司
主分类号: C40B50/06 分类号: C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/6806;C12Q1/6869;G16B20/10;G16B20/20;G16B30/00;G16B50/00
代理公司: 南京鼎坤专利代理事务所(普通合伙) 32681 代理人: 王芳芳
地址: 215125 江苏省苏州市苏州*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 基于 通量 技术 检测 拷贝 变异 文库 构建 方法
【权利要求书】:

1.一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述构建方法包括以下步骤:

S1、待测样本的处理和模板的提取;

S2、使用内切酶对模板进行酶切;

S3、酶切完成后按接头Mix配制数据配制接头Mix;

S4、片段双选;

S5、文库扩增;

S6、PCR产物纯化;

S7、DNA文库质检;

S8、文库测序。

2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S1进一步的包括以下步骤:

样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织,甲醛固定石蜡包埋病理组织,石蜡切片及血液等标本;

蜡块样品切成5~8μM切片,取5片,或已经制成的5~8μM切片取5片,经过脱蜡剂脱蜡后,使用石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA;

新鲜病理组织使用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA;

血液样本使用提取试剂盒提取基因组DNA;

所提DNA溶于1×TE,使用Qubit 4.0对提取好的DNA进行定量,确认模板浓度后使用1×TE溶液调整DNA浓度到10ng/μL作为PCR扩增的模板。

3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S4进一步的包括以下步骤:

将连接产物转移至1.5mL离心管中,加入70μL无核酸酶水补足至100μL,加入60μL DNA纯化磁珠,混匀后室温放置5分钟;

放置到磁力架上,然后磁力架上放置4分钟至液体澄清,转移上清至新的1.5mL离心管中;

加入18μL DNA纯化磁珠,混匀后室温放置5分钟,放置到磁力架上,等液体清亮,去上清,用200μL的80%酒精清洗;

室温干燥后用22μL Low TE提取DNA,取20μL溶液于新的0.2mL PCR管中。

4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S5进一步的包括以下步骤:

S51、按照配制表配制反应体系;

S52、按扩增程序数据扩增程序进行PCR扩增。

5.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S6进一步的包括以下步骤:

S61、向PCR产物管中加入50uL磁珠,用移液器吹打混匀,室温孵育2min;

S62、将孵育完成的产物管放置到磁力架上进行磁珠吸附,待溶液澄清后,小心吸取上清,弃上清保留磁珠;

S63、向上步PCR管中加入200uL80%的乙醇,用磁力架快速在PCR管不同的面吸附2-3次,充分洗涤磁珠,静置15s后,用移液器小心吸取上清,弃上清保留磁珠;

S64、重复步骤S63一次;

S65、将含有磁珠的PCR管置于磁力架上室温静置,待到管中乙醇完全挥发后,向PCR管中加入20uL无核酸酶水,充分混匀洗涤磁珠后静置2min;

S66、将孵育完成的产物管放置到磁力架上进行磁珠吸附,待溶液澄清后,小心吸取上清转移至新的PCR管中,即为洗脱得到的DNA文库,弃去磁珠。

6.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S7进一步的包括:使用Qubit 4.0对文库浓度进行测定,使用labchip对文库的片段大小进行测定。

7.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S8进一步的包括:

测序使用Miseq测序仪进行测序,使用V2芯片,测序读长PE150;

测序完成后得到目标序列信息,即fastq文件;

然后将上述获得的fastq文件经生信分析处理,通过与野生型序列信息进行比对得到基因突变信息。

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