[发明专利]一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法在审
申请号: | 202211679381.1 | 申请日: | 2022-12-26 |
公开(公告)号: | CN115976654A | 公开(公告)日: | 2023-04-18 |
发明(设计)人: | 刘增玮 | 申请(专利权)人: | 苏州璞瑞卓越生物科技有限公司 |
主分类号: | C40B50/06 | 分类号: | C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/6806;C12Q1/6869;G16B20/10;G16B20/20;G16B30/00;G16B50/00 |
代理公司: | 南京鼎坤专利代理事务所(普通合伙) 32681 | 代理人: | 王芳芳 |
地址: | 215125 江苏省苏州市苏州*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 通量 技术 检测 拷贝 变异 文库 构建 方法 | ||
1.一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述构建方法包括以下步骤:
S1、待测样本的处理和模板的提取;
S2、使用内切酶对模板进行酶切;
S3、酶切完成后按接头Mix配制数据配制接头Mix;
S4、片段双选;
S5、文库扩增;
S6、PCR产物纯化;
S7、DNA文库质检;
S8、文库测序。
2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S1进一步的包括以下步骤:
样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织,甲醛固定石蜡包埋病理组织,石蜡切片及血液等标本;
蜡块样品切成5~8μM切片,取5片,或已经制成的5~8μM切片取5片,经过脱蜡剂脱蜡后,使用石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA;
新鲜病理组织使用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA;
血液样本使用提取试剂盒提取基因组DNA;
所提DNA溶于1×TE,使用Qubit 4.0对提取好的DNA进行定量,确认模板浓度后使用1×TE溶液调整DNA浓度到10ng/μL作为PCR扩增的模板。
3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S4进一步的包括以下步骤:
将连接产物转移至1.5mL离心管中,加入70μL无核酸酶水补足至100μL,加入60μL DNA纯化磁珠,混匀后室温放置5分钟;
放置到磁力架上,然后磁力架上放置4分钟至液体澄清,转移上清至新的1.5mL离心管中;
加入18μL DNA纯化磁珠,混匀后室温放置5分钟,放置到磁力架上,等液体清亮,去上清,用200μL的80%酒精清洗;
室温干燥后用22μL Low TE提取DNA,取20μL溶液于新的0.2mL PCR管中。
4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S5进一步的包括以下步骤:
S51、按照配制表配制反应体系;
S52、按扩增程序数据扩增程序进行PCR扩增。
5.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S6进一步的包括以下步骤:
S61、向PCR产物管中加入50uL磁珠,用移液器吹打混匀,室温孵育2min;
S62、将孵育完成的产物管放置到磁力架上进行磁珠吸附,待溶液澄清后,小心吸取上清,弃上清保留磁珠;
S63、向上步PCR管中加入200uL80%的乙醇,用磁力架快速在PCR管不同的面吸附2-3次,充分洗涤磁珠,静置15s后,用移液器小心吸取上清,弃上清保留磁珠;
S64、重复步骤S63一次;
S65、将含有磁珠的PCR管置于磁力架上室温静置,待到管中乙醇完全挥发后,向PCR管中加入20uL无核酸酶水,充分混匀洗涤磁珠后静置2min;
S66、将孵育完成的产物管放置到磁力架上进行磁珠吸附,待溶液澄清后,小心吸取上清转移至新的PCR管中,即为洗脱得到的DNA文库,弃去磁珠。
6.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S7进一步的包括:使用Qubit 4.0对文库浓度进行测定,使用labchip对文库的片段大小进行测定。
7.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术检测拷贝数变异的文库构建方法,其特征在于:所述S8进一步的包括:
测序使用Miseq测序仪进行测序,使用V2芯片,测序读长PE150;
测序完成后得到目标序列信息,即fastq文件;
然后将上述获得的fastq文件经生信分析处理,通过与野生型序列信息进行比对得到基因突变信息。
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