[发明专利]一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法

权利要求书

1.一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：根据SNaPshot分型技术，设计4个SNP位点引物，包括扩增引物、延伸引物，并对扩增引物进行blast特异性比对；

步骤二：提取待测猫的口腔拭子基因组DNA；

步骤三：以待测猫的口腔拭子基因组DNA为模板，利用引物组合进行多重SNaPshot分型检测：包括多重PCR扩增；PCR产物纯化；多重延伸反应；延伸产物纯化；

步骤四：毛细管电泳，分析延伸产物，从而对猫血型进行判定。

2.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤一中扩增名称为CMAH179-F、CMAH179-R、CMAH268-F、CMAH268-R、CMAH364-F、CMAH364-R、CMAH1322-F、CMAH1322-R；延伸引物名称为CMAH179-YS-F、CMAH268-YS-F、CMAH364-YS-F、CMAH1322-YS-F。

3.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤一中还包括以下步骤，

a：将扩增引物及延伸引物干粉12000rpm，离心2分钟；

b：按照引物合成说明书，用TE将干粉引物稀释至100μM；

c：再分别将扩增引物上下游稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重扩增引物；

d：将延伸引物稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重延伸引物。

4.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤二中采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。

5.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤三中多重PCR扩增步骤如下，

a：预先将PCR扩增组分取出置冰上融化，10×buffer、dNTP、多重扩增引物混合液轻微震荡混匀，离心备用，Hstaq酶离心置于冰上备用；

b：配置PCR扩增混合液，每反应分装9μL；

c：加样，在9μL扩增反应体系中加入1μL DNA；

d：扩增，在PCR仪上进行PCR程序扩增，扩增程序如下：

95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、65℃～55℃每循环降低1℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行10个循环；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行25个循环；之后72℃延伸10分钟，4℃保存。

6.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤三中PCR产物纯化步骤如下，

a：取4μL多重PCR产物；

b：加入2U SAP酶和2U Exonuc lease I酶；37℃温浴1小时；

c：75℃灭活20分钟。

7.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤四中产物毛细管电泳检测步骤如下，

a：取1μL SAP处理完的延伸产物；

b：加入8.8μL HIDI及0.2μL Liz120，95℃变性3分钟；

c：立即冰浴2分钟，用测序仪进行测序。

8.根据权利要求7所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述测序完成后用genemapper6.0对分型结果进行判读，根据延伸引物大小设置panel、bin，依据出峰的位置及颜色判断每个位点的分型。