[发明专利]一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法

说明书

本发明公开了一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，对猫CMAH基因上的4个单核苷酸突变位点进行检测。其特征在于：检测猫血型的单核苷酸突变位点包括：CMAH 179GT，CMAH 268TA，CMAH 364CT，CMAH1322delT。本发明采用SNaPshot技术进行SNP分型检测，一次性可以检测多个位点，取样量少，且准确度高，结果容易判读。通过对猫血型检测，可有效避免新生儿溶血和输血不良反应。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法。

背景技术

我们的伴侣动物猫跟人一样，拥有自己的血型系统。猫公认的血型系统为AB型血型系统，包括3种血型：A型、B型和AB型。其中A型最常见，在不同的品种中，猫A血型高达90％。A型、B型和AB型的显隐性关系为：A型显性AB型显性B型显性。

宠物主人平时很少会想到检测猫的血型，除非自己的猫咪需要输血。和人一样，猫咪如果输错血型也很危险。在临床治疗中，当猫遇到外科手术、事故、贫血等需要输血的情况，如果没有输入相配的血，死亡的几率会很大。在繁育时，准确知道猫咪血型对繁育者意义重大，如果B型母猫与A型公猫交配，产下A型或AB型幼猫，当幼猫饮用母乳时则会造成红细胞破坏发生溶血，即新生儿溶血。这是因为B型母猫分娩后，乳汁中存在大量的A抗体，会攻击幼猫的红细胞，导致幼猫溶血症。据统计，新生猫溶血是造成新生幼猫死亡的最主要因素之一。因此，无论是临床还是繁育，提前了解猫咪的血型都十分重要。

目前常用的分型检测方法有Sanger测序、Taqman探针、Massarray等方法。Sanger测序一次仅能检测一个位点，费用高且耗时长；Taqman探针对探针的特异性要求高，不易设计；Massarray要求样本量多，准确度低。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，包括以下步骤：

步骤一：根据SNaPshot分型技术，设计4个SNP位点引物，其包括扩增引物、延伸引物，并对扩增引物进行blast特异性比对；

步骤二：提取待测猫的口腔拭子基因组DNA；

步骤三：以待测猫的口腔拭子基因组DNA为模板，利用引物组合进行多重SNaPshot分型检测：包括多重PCR扩增；PCR产物纯化；多重延伸反应；延伸产物纯化；

步骤四：毛细管电泳，分析延伸产物，从而对猫血型进行判定。

优选的，所述步骤一中扩增名称为CMAH179-F、CMAH 179-R、CMAH268-F、CMAH268-R、CMAH364-F、CMAH364-R、CMAH1322-F、CMAH1322-R；延伸引物名称为CMAH179-YS-F、CMAH268-YS-F、CMAH364-YS-F、CMAH1322-YS-F。

优选的，所述步骤一中还包括以下步骤，

a：将扩增引物及延伸引物干粉12000rpm，离心2分钟；

b：按照引物合成说明书，用TE将干粉引物稀释至100μM；

c：再分别将扩增引物上下游稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重扩增引物；

d：将延伸引物稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重延伸引物。

优选的，所述步骤二中采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。

优选的，所述步骤三中多重PCR扩增步骤如下，

a：预先将PCR扩增组分取出置冰上融化，10×buffer、dNTP、多重扩增引物混合液轻微震荡混匀，离心备用，Hstaq酶离心置于冰上备用；