[发明专利]具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株

说明书

本发明公开具有XNA合成及反转录活性的Bst DNA聚合酶突变株。包括Bst DNA聚合酶突变株Sso7d‑Bst、Bst DNA聚合酶突变株Bst(I659E,E660G)和Bst DNA聚合酶突变株Sso7d‑Bst(I659E,E660G)；所述Bst DNA聚合酶突变株既能识别及合成天然DNA，又能识别、合成及反转录RNA以及2’‑F、2’‑OMe修饰核酸的Bst DNA聚合酶突变株。本发明提供的三种Bst DNA聚合酶突变株，与野生型相比能够既能高效转录RNA和2’‑OMe–RNA，又能够高效反转录2’‑OMe–RNA。

技术领域

本发明属于酶分子改造领域，具体涉及Bst DNA聚合酶的突变株及其应用与编码突变体的基因。

背景技术

天然的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，是所有生命遗传信息的载体。DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶，则是生命体中最为关键的酶，在遗传信息的储存，使用和传递过程中发挥着关键作用。非天然核酸(XNAs)是指具有非天然结构单元的DNA/RNA的类似物，其制备方法包括对天然核酸的骨架、糖环和碱基进行修饰。XNA近年来逐渐成为了遗传信息的新型载体，其开发促进了异种生物学领域的快速发展。

XNA当中，含有糖基修饰的XNA是一种研究比较深入的XNA，包括苏糖核酸(TNA)、己糖醇核酸(HNA)、d-糖三醇核酸(AtNA)、环己烯基核酸(CeNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯核酸(ANA)、2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、2’-F-DNA和2’-OMe-DNA等。这些XNA有的可被各种天然聚合酶和工程聚合酶识别。部分XNA双链比DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链更加稳定，同时一些XNA对核酸酶也具有较高的抗性。因此，XNA在开发具有优良生理稳定性的核酸适配体和生物材料等应用中体现出了巨大的优势。

然而，由于较高的底物特异性，天然的聚合酶难以高效识别非天然核酸，因而遗传信息在DNA和XNA之间的传递，如XNA的转录和逆转录都难以实现。为了解决这一问题，研究人员通过定向进化、理性设计或半理性设计对核酸聚合酶进行设计和改造，使其能够识别并合成非天然核酸分子。比如，Holliger组进化获得了一系列Tgo聚合酶的突变株，其能够合成和反转录各种XNA，如HNA、TNA、FANA和ANA等。Chaput组获得的KOD聚合酶突变株RSGA对TNA底物的特异性显著增强。Romesberg组基于噬菌体展示技术对Taq DNA聚合酶的Stoffel片段进行了定向进化，获得了聚合酶突变株SFM4-3、SFM4-6和SFM4-9，其中SFM4-3不仅可以转录全2’-OMe修饰的非天然核酸，而且可以通过PCR扩增得到部分2’-OMe或2’-F修饰的核酸链。

嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)是DNA聚合酶A家族的一员，由于具有较强的热稳定性、链置换活性以及聚合酶活性，被广泛应用于各种等温扩增技术。其中，环介导等温扩增(LAMP)针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在Bst DNA聚合酶的作用下短时间内即可实现DNA的指数扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点，是一种功能强大且应用广泛的诊断方法，比如对SARS-CoV-2的检测；滚环扩增(RCA)以一小段环状寡核苷酸为模板，在Bst DNA聚合酶的作用下扩增产生一条长重复单链的DNA，目前也已经广泛应用于基因组学、蛋白组学、分子诊断、生物传感、药物研发等领域。开发能够识别XNA的Bst聚合酶突变株，将有望实现对于XNA的等温扩增及滚环扩增，从而大大拓展XNA的应用范围。

Sso7d来自于嗜热古生菌Sulfolobus solfataricus，是一种分子量只有7kDa的带正电荷的DNA结合蛋白，与DNA结合后可以增加DNA的负超螺旋,并且能够提高DNA的熔解温度。Sso7d可以作为拼接蛋白连接DNA和其他有机分子,也可以作为支架蛋白把多个蛋白连接为一个功能性的复合体并促进其互相作用。Sso7d和很多DNA聚合酶(比如Pfu)的融合可以极大地提高这些聚合酶的合成速度和连续性。