[发明专利]检测海豚链球菌的实时荧光MIRA和MIRA-LFD引物组及检测方法

说明书

本发明公开了一种检测海豚链球菌的实时荧光MIRA和MIRA‑LFD引物组及检测方法，属于分子生物学领域；所述引物组包括SEQ IDNO.1及SEQ ID NO.2所示的引物及各自的探针，虽然针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。实验证明本发明的两种方法的灵敏性均为10supgt;2/supgt;cfu/ml菌液提取的DNA，远远低于海豚链球菌的发病浓度。因此，本发明的两种方法能快捷、高效、灵敏的检测海豚链球菌，为海豚链球菌的鉴别诊断提供有效技术手段。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测海豚链球菌的实时荧光MIRA和MIRA-LFD引物组及检测方法。

背景技术

海豚链球菌属于芽孢杆菌纲、乳杆菌目、链球菌科、链球菌属，是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，为球形或卵圆形，有荚膜，无鞭毛，无运动性，不形成芽孢，具有感染宿主广、传染性强、死亡率高等特点。海豚链球菌可以感染包括淡水鱼和海水鱼在内的二十多种鱼类，给水产养殖业造成巨大损失。而在海豚链球菌病的治疗上主要依赖于多种抗生素的使用，大量抗生素的使用不仅导致了菌的耐药性，也破坏水体的稳定性，因此海豚链球菌的早期预防就显得尤为重要。

传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，该方法步骤繁琐、操作复杂且耗时费力。即便是近年来常用的PCR扩增法，也需要依赖于昂贵的实验仪器和熟练地技术人员，从而也导致了这些方法不能应用于基层以及即时检验。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种基于多酶恒温快速扩增技术(MIRA)检测海豚链球菌的实时荧光MIRA和MIRA-LFD引物组及检测方法，所述方法以基础的核酸扩增产品能够在15-30min内完成扩增，并有实时荧光型和试纸条型两种检测方法。相较于PCR扩增方法，极大的缩短了扩增时间，提高了扩增效率。相比于琼脂糖凝胶电泳技术进行扩增检测，试纸条型检测方法不仅不需要再依赖于昂贵的凝胶成像仪，而且在检测时间上也大大缩短。相比于实时荧光PCR法，实时荧光MIRA法所需时间大为缩短，整个时间缩短至20-30min。因此，不论是实验室还是一些条件相对落后的基层都可以实现海豚链球菌的快速鉴定。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种检测海豚链球菌的实时荧光MIRA引物组，其由引物1、引物2和探针1组成；

所述引物1为如下(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；具体为5’-TAAAGCATTAGAAGCGGCTAAGAAAGAAG-3’

(a2)将SEQ ID NO.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.1具有相同功能的DNA分子；

所述引物2为如下(a3)或(a4)：

(a3)SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子；具体为5’-CAATAGTTGCTTCAAGTTCTGCTTTTTCA-3’

(a4)将SEQ ID NO.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.2具有相同功能的DNA分子；

所述探针1为如下(a5)或(a6)

(a5)SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子，具体为5’-TTTCCAATTCAGCTTTTGTTTCTGCTAGTAGTTTCAAGGTCTT TAG-3’；且探针1的5’端第29个碱基上标记

i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT；

(a6)SEQ ID NO.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.3具有相同功能的DNA分子，且探针5’端第29个碱基上标记i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT；