[发明专利]一种提高磷脂酶D合成PS活性的单点突变方法

权利要求书

1.一种磷脂酶D的突变蛋白，对磷脂酶D的氨基酸序列进行点突变，所述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；

所述突变的点位为：D175A、D175L、S451A、S451L、T194A、T194L、S457A、S457L、T194I、T194V、T194M、T194F、T194C或T194P。

2.一种表达权利要求1所述突变蛋白的重组菌。

3.根据权利要求2所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。

4.根据权利要求2或3重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养野生型E.coli TOP10/pBADKP-PLD2，其中载体为质粒pBADKP，宿主细胞为E.coli TOP10，具体构建方法见专利CN109136207B；

(2)利用Plasmid Mini KitⅠ试剂盒从菌株E.coli TOP10/pBADKP-PLD2中提取含有SEQID NO.1所示氨基酸序列编码基因的质粒pBADKP，将质粒pBADKP作为突变PCR的模板；

(3)利用定点突变引物对质粒进行PCR扩增，得到扩增产物；

(4)利用DpnⅠ酶消化扩增产物未突变的模板DNA，得到消化产物；

(5)将消化产物用热激发导入E.coli top10感受态细胞，通过含有卡那霉素抗性的LB固体培养基进行单克隆的筛选，得到所述重组菌。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的定点突变引物包括：针对D175A点突的突变引物D175A-F和D175A-R，所述D175A-F的核苷酸序列如包括SEQ IDNO.2所示，所述D175A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

针对D175L点突的突变引物D175L-F和D175L-R，所述D175L-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.4所示，所述D175L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

针对D451A点突的突变引物D451A-F和D175A-R，所述D451A-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.6所示，所述D451A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

针对D451L点突的突变引物D451L-F和D175L-R，所述D451L-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.8所示，所述D451L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

针对T194A点突的突变引物T194A-F和D175A-R，所述T194A-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.10所示，所述T194A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

针对T194L点突的突变引物T194L-F和D175L-R，所述T194L-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.12所示，所述T194L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

针对D457A点突的突变引物D457A-F和D175A-R，所述D457A-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.14所示，所述D457A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

针对D457L点突的突变引物D457L-F和D175L-R，所述D457L-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.16所示，所述D457L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

针对T194I点突的突变引物T194I-F和D175A-R，所述T194I-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.18所示，所述T194I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

针对T194V点突的突变引物T194V-F和D175A-R，所述T194V-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.20所示，所述T194V-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

针对T194M点突的突变引物T194M-F和D175A-R，所述T194M-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.22所示，所述T194M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；

针对T194F点突的突变引物T194F-F和D175A-R，所述T194F-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.24所示，所述T194F-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；

针对T194C点突的突变引物T194C-F和D175A-R，所述T194C-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.26所示，所述T194C-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

针对T194P点突的突变引物T194P-F和D175A-R，所述T194P-F的核苷酸序列如包括SEQID NO.28所示，所述T194P-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。