[发明专利]一种提高磷脂酶D合成PS活性的单点突变方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种提高磷脂酶D合成PS活性的单点突变方法，本方案通过文献对比确定ZET4的活性中心，再通过AutoDock Vina将PLD(2ZE4)分别与底物PC和L‑ser进行分子对接，确定底物分子与酶分子的绑定位点，进行蛋白突变设计，设计引物构建了14个突变菌株，有8个突变菌株表达的磷脂酶D提高了合成PS的活性，其中T194A和T194L的PS产率由27.46％提高到53.56％和49.23％；T194I、T194V、T194M、T194F、T194C和T194P的PS转化率均有不同程度的提高，其中T194I磷脂酶D的PS产率达到了58.32％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高磷脂酶D合成PS活性的单点突变方法。

背景技术

磷脂(Phospholipids)是含有磷酸基化合物的统称，分子结构由2条疏水长碳链和1个极性头部组成。磷脂最早被发现于蛋黄中，是生命体细胞膜的主要组成成分，广泛分布于动植物的各种细胞组织内，承担着信号传导和促进新陈代谢的重任。磷脂的主要生理活性功能是由它的极性头部决定的，根据极性头部的种类，磷脂可以被分为：磷脂酰胆碱(Phatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylerhanolamine，PE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol，PG)等。虽然磷脂在自然界分布广泛，种类繁多，但是这些磷脂在自然界中分布却十分不均匀。其中，PS是存在于细胞膜上必不可少的活性物质，可以调控膜蛋白可以被人体快速吸收，高效穿越脑血屏障，安全地减缓甚至修复人脑中神经细胞的受损细胞膜。从而达到改善患者认知能力，学习能力和记忆能力的功效，对阿尔兹海默症的治疗具有一定的辅助作用。主要从大豆中提取获得，也存在于大脑细胞和花生中。在动物中，PS主要存在于大脑和肝脏的细胞中，由于动物容易染病使产品的安全性受到了威胁；在植物中，磷脂含量较多的是PC，相对而言，PS的含量很少，提取困难。所以，利用酶转化法合成PS应运而生，具有操作稳定、高度专一性等优势。

磷脂酶D(PLD)是特殊的磷脂水解酶，能够催化磷脂水解，释放原来磷脂的极性头部，生成磷脂酸(PA)。此外，在含有第二底物(亲核试剂，如丝氨酸，乙醇胺，甘油等)条件下，磷脂酶D能够催化裂解磷脂磷酸二酯键发生断裂，并促进磷酰基与亲核试剂结合，生成新的磷脂。PLD催化的磷脂酰基转移反应是目前使用最为广泛，也是最有效的PS人工合成方法。

但是，目前已知的PLD磷脂酰基转移活力，反应选择性和稳定性都有待提高。分子对接(Molecular Docking)技术研究底物与酶结合的可能性，配合分子动力学(MolecularDynamics)模拟确定结合复合物稳定性，进一步通过底物与酶结合自由能计算(BindingFree Energies Analysis)判断反应进行的方向和程度。利用蛋白质理性设计，可以最大程度降低定点突变的实验工作量，考虑每个突变位点都有20种突变情况(19种替换突变和1种删除突变)，利用生物分子模拟技术可以虚拟筛选突变体文库，大大提高实际突变效率。目前关于虚拟突变PLD催化性能的研究几乎没有报道，且PLD催化性能有待提高。

发明内容

本发明意在提供一种提高磷脂酶D合成PS活性的单点突变方法，以提高PLD催化性能。

为达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种磷脂酶D的突变蛋白，对磷脂酶D的氨基酸序列进行点突变，所述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；所述突变的点位为：D175A、D175L、S451A、S451L、T194A、T194L、S457A或S457L。

本发明还提供了一种表达上述突变蛋白的重组菌。

优选的，作为一种改进，所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。

本发明还提供了上述重组菌的构建方法，包括以下步骤：