[发明专利]一种黄素单加氧酶制备酚类化合物的方法

说明书

本发明公开了一种黄素单加氧酶制备酚类化合物方法，是采用4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶与NAD(P)H‑黄素氧化还原酶共表达作为反应催化剂，以单酚类化合物、NADH和FAD为底物，Osubgt;2/subgt;为氧化剂，反应得到酚类化合物。本发明创新性地利用4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶与NAD(P)H‑黄素氧化还原酶共表达双酶级联体系，提高了4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶的活力，高效绿色的合成酚类化合物，具有反应条件温和、工艺步骤简单、成本低且合成效率高等优点﹐为酚类化合物的绿色生产提供了一种新方法。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酚类化合物的合成制备方法。

背景技术

橄榄和橄榄油中的橄榄多酚对人体有许多健康益处，羟基酪醇是橄榄多酚最主要的成分，主要以酯类的形式存在油橄榄的果实和树叶中。羟基酪醇的健康功效非常广泛，被认为是最强大的抗氧化剂之一，同时具有多种生物和药理活性。羟基酪醇不仅可以预防心血管疾病、调节代谢综合征、抗炎、抗肿瘤、预防和调节呼吸系统疾病，表现出明显的抗菌效果，同时还具有保护神经和皮肤的作用，并且对骨骼的形成和维持产生重要影响。羟基酪醇无明显毒性反应，其在医药、食品和化妆品行业的应用前景近年受到广泛关注。

目前，羟基酪醇的制备方法有直接提取法、化学合成法以及生物酶法制备。由于橄榄和橄榄油的商业需求，大多数天然羟基酪醇在橄榄废弃物(如橄榄废水、半固体副产品或橄榄叶等)中通过有机溶剂、酸或酶直接提取得到。然而，从橄榄废弃物中提取羟基酪醇耗时长且效率低，化学合成法反应过程复杂且试剂难以完全分离，环境污染较大，因此酶法制备羟基酪醇成为人们研究的热点，具有广阔的应用前景。

酶法制备羟基酪醇以酪醇为底物，通过单加氧酶将酪醇羟基化得到酚类化合物羟基酪醇，该方法具有较高的催化效率并且对环境更友好。黄素单加氧酶(Flavoproteinmonooxygenases，FPMOs)属于氧化还原酶类，能够在温和条件下活化分子氧，从而将底物氧化，是一类被广泛应用的单加氧酶。4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶B(4-hydroxyphenylacetate3-monooxygenaseB；HpaB)是一种来源于大肠杆菌的黄素单加氧酶，具有广泛的底物特异性，可以催化黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体(FADH₂)、氧分子与底物酚类化合物发生反应，可用于将酪醇羟基化得到羟基酪醇。然而体外生物系统的构建经常出现依赖于辅助因子的反应中需要昂贵的辅助因子的问题，限制了酶的实际应用，因此开发FADH₂高效生成系统成为催化反应过程优化的重要一部分。

NAD(P)H-黄素氧化还原酶(NAD(P)H-flavinoxidoreductase；HpaC)以NADH作为电子供体催化游离黄素的还原，进行黄素间氢离子的传递，该酶不含任何辅基，在氧化还原前同时容纳还原的吡啶核苷酸和黄素。以还原型辅酶Ⅰ(NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为底物，生成NAD⁺和FADH₂，上述HpaB则利用FADH₂催化酚类化合物的羟基化。酶体外级联反应已成为一种环境友好和经济的有价值化学品生产的替代方法，将HpaB和HpaC进行级联共表达进行以黄素、单酚为底物合成双酚的反应，可以防止没有底物时FADH₂的浪费氧化，节约成本的同时可以绿色无污染的高效进行羟基酪醇的酶法合成，在工业应用中具有重要意义。

因此，我们建立了4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶HpaB和NAD(P)H-黄素氧化还原酶HpaC双酶级联体系制备羟基酪醇的合成路径。

发明内容

提供了一种黄素单加氧酶制备酚类化合物的方法。

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有条件确定酚类化合物的合成路径，将HpaB进行表达，提供了一种黄素单加氧酶制备酚类化合物方法。本发明另一个目的是提供一种双酶级联体系，将HpaC进行表达，实现了黄素分子间氢的转移，高效获得FADH₂，节约了成本。将HpaB与HpaC共表达，提高了HpaB的催化活性，实现了羟基酪醇的高效合成。