[发明专利]一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及检测方法

说明书

本发明属于鰤鱼诺卡氏菌检测鉴定技术领域，具体公开了一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及检测方法，本发明设计了鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及利用上述鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合进行多重PCR检测，对于检测目标鰤鱼诺卡氏菌具备良好的效果，且具有显著特异性及较高灵敏度，引物对组合(Chen‑F/R、Miyoshi‑F/R、Jiang‑F/R)低至1ng/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Chen‑F/R、4296‑F/R、Jiang‑F/R)低至62.5pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Labrie‑F/R、Chen‑F/R、Jiang‑F/R)低至250pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(4296‑F/R、4001‑F/R、4299‑F/R)低至500pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Labrie‑F/R、Chen‑F/R、4298‑F/R)低至1.2ng/μL混合样品仍可被检出。

技术领域

本发明涉及鰤鱼诺卡氏菌检测鉴定技术领域，特别是一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及检测方法。

背景技术

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原，为一种革兰氏阳性好氧菌，鰤鱼诺卡氏菌可以引起鱼类“结节病”症状，使患病鱼的体表出现不同程度的溃疡，且其肝脏、肾脏、脾脏等内脏器官和肌肉、鳃等组织出现白色结节，引起慢性、传染性疾病。由于夏季水温一般可达25-28℃，是适合鰤鱼诺卡氏菌生长的温度，所以诺卡氏菌病发病时间大多集中于夏季。鱼类感染该病前期没有明显的症状表现，大概经过两周后，病鱼摄食能力与活动能力都会降低，沉于水底。鱼类伴随着感染鰤鱼诺卡氏菌的时间增加，其组织与器官会出现白色结节。据可靠数据统计，感染该病后鱼类死亡率最高可达90％，未及时发现鱼类患病迹象，很难有效控制鱼类死亡而带来的经济损失。

近年来，鱼类诺卡氏菌病越来越引起学者的关注，有很多快速检测方法也应运而生。利用16S rRNA基因建立鰤鱼诺卡氏菌的特异性PCR检测方法(Miyoshi，2003)。利用16SrRNA～23S rRNA转录间隔区建立诺卡氏菌real-time PCR检测方法(王国良，2012)。利用rpoB基因建立诺卡氏菌real-time PCR检测方法(孙渭歌，2014)和王国良等(2011)利用LAMP技术以16S～23S rRNA建立鱼类诺卡氏菌特异性检测方法(Itano，2006)。目前对于鰤鱼诺卡氏菌的检测，尚未见多重PCR检测方法的报道。由此可见，为了更加快速准确地确定致病菌，建立一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的检测方法，从而快速准确地对鰤鱼诺卡氏菌进行检测鉴定，是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及检测方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

本发明的第一个目的是要提供一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合，该引物对组合为Chen-F/R、Miyoshi-F/R、Jiang-F/R，Chen-F/R、4296-F/R、Jiang-F/R，Labrie-F/R、Chen-F/R、Jiang-F/R，4296-F/R、4001-F/R、4299-F/R，Labrie-F/R、Chen-F/R、4298-F/R五种组合中的一种，各引物的序列如下表：

进一步地，所述引物对组合中各引物对的浓度比例Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1，Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1，Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1，4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2，Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2。

本发明的第二个目的是要提供一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，利用上述鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合进行多重PCR检测，具体包括：