[发明专利]一种生产白喉毒素无毒突变蛋白的方法及其使用的特异DNA分子

说明书

本发明公开了一种表达和生产白喉毒素无毒突变蛋白的方法及其使用的特异DNA分子，白喉毒素无毒突变蛋白即CRM197蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的方法可以在周质中产生CRM197蛋白，与胞内产生CRM197蛋白相比，周质产生CRM197蛋白具有如下优势：切割信号肽后，蛋白以其成熟形式产生；大肠杆菌的周质是氧化环境，其允许形成二硫键，这可帮助产生可溶性、正确折叠的蛋白；周质含有较少的蛋白，可以获得更纯的CRM197蛋白。此外，本发明在周质中产生的CRM197蛋白比现有技术中在周质中产生的CRM197蛋白的表达量高，即获得了较高得率的CRM197蛋白。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达或生产白喉毒素无毒突变蛋白的方法及其使用的特异DNA分子，白喉毒素无毒突变蛋白即CRM197蛋白。

背景技术

CRM197是一种无毒形式的白喉毒素，但与白喉毒素免疫学上无法区分。CRM197蛋白与白喉毒素具有相同的分子量，但与它的不同在于结构基因中的单碱基改变，因其1个碱基G突变为A，使第52位甘氨酸变成谷氨酰胺，造成酶活位点的改变，无法与NAD结合，导致其丧失细胞毒性。即CRM197蛋白无毒且保留了白喉毒素的免疫原性，是一种较理想的多糖结合疫苗载体蛋白，通过与其他抗原相交联，提高了疫苗的免疫原性，因此具有广阔的应用前景。

白喉类毒素和具有无毒突变体形式CRM197是许多抗白喉棒状杆菌免疫性的疫苗中的组分。白喉毒素和包括CRM197在内的突变体形式也作为对糖安全和有效的T细胞依赖载体用于疫苗中。CRM197目前用于乙型流感嗜血杆菌寡糖CRM197缀合物疫苗中。

用于制备白喉类毒素(DT)的方法在本领域是公知的。例如，DT可通过从白喉棒状杆菌的培养物中纯化毒素后化学解毒而产生，或者可通过纯化毒素的重组体或遗传学上解毒的类似物来制备。由于低蛋白丰度，阻碍了用于疫苗中的白喉毒素的产生。例如Bishai等发现含有白喉毒素(包含tox信号序列)的重组融合蛋白的表达，这导致降解蛋白的产生。克隆含有tox信号序列的白喉片段并将这些序列在大肠杆菌中表达牵涉某些困难。表达的蛋白被分泌到周质间隙中，而该分泌与宿主细胞的降低的生存力和重组蛋白增加的蛋白酶解相关。

很多研究人员通过多种方法改善CRM197蛋白在原核细胞中的表达，但CRM197蛋白的表达量都没有很好地改善，而且有些还会影响CRM197蛋白活性。大肠杆菌的周质是氧化环境，其允许形成二硫键，这可帮助产生可溶性、正确折叠的蛋白。同时大肠杆菌的周质与胞内相比含有更少的蛋白酶，这可帮助避免蛋白酶剪切表达的蛋白；周质还含有较少的蛋白，这允许获得更纯的重组蛋白。因此，迫切需要建立一种用于通过周质表达制备CRM197蛋白的方法。

发明内容

本发明的目的为通过周质表达制备CRM197蛋白(即白喉毒素无毒突变蛋白)。

本发明首先保护一种多肽，其包括信号肽和白喉毒素无毒突变蛋白；所述信号肽包括但不限于信号肽FIGI、信号肽SipA、信号肽YTFQ、信号肽OMPF等。

所述信号肽可为如下A1)-A5)中任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No：4的信号肽FIGI；

A2)氨基酸序列是SEQ ID No：6的信号肽SipA；

A3)氨基酸序列是SEQ ID No：8的信号肽YTFQ；

A4)氨基酸序列是SEQ ID No：10的信号肽OMPF；

A5)将A1)-A4)所述信号肽经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)-A4)的多肽具有80％以上的同一性且具有相同功能的信号肽。

上述多肽中，所述白喉毒素无毒突变蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID NO：1所示。