[发明专利]酰基辅酶A氧化酶的制备方法和应用

说明书

本申请公开了一种酰基辅酶A氧化酶的制备方法和应用。本申请中本发明通过基因工程技术从大量含酰基辅酶A氧化酶的菌种源中筛选出可表达高酶活可溶性酰基辅酶A氧化酶的菌源，并提供了相应的工业化生产酰基辅酶A氧化酶的方法，该方法纯化步骤简单、产出的酶活性高、蛋白表达量高且生产成本低。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及酰基辅酶A氧化酶的制备方法和应用。

背景技术

酰基辅酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase，ACX/ACO)广泛存在于多种生物体中，位于过氧化物酶体，参与过氧化物酶体中各类脂肪酸β氧化的第一步反应，该酶也是脂肪酸活化代谢的限速酶。ACX基因家族共有6个同工酶，根据催化反应中识别碳链长短不同可分为三类。分别是：识别长链脂肪酸的Long-chain ACX(LACX)、识别中链脂肪酸的Medium-chainACX(MACX)和识别短链脂肪酸的Short-chain ACX(SACX)。在体外诊断领域，酰基辅酶A氧化酶催化酰基辅酶A的氧化反应，可用于血液中游离脂肪酸浓度的检测。

酰基辅酶A氧化酶可以从天然产物中制备，比如植物、微生物，这类制备方法多采用Tris-HCl缓冲液、磷酸钾缓冲液萃取法，为了提高纯度，经常多种纯化工艺联用，比如：丙酮提取，热处理，硫酸铵沉淀和苯基琼脂糖层析，羟基磷灰石分子筛柱。这些步骤复杂，需要多种物质材料，产率较低，很难应用于工业上大规模生产。如文献《热带假丝酵母酰基辅酶A氧化酶的纯化及性质研究》中公开了从热带假丝酵母菌中提取目的蛋白并进行纯化的方法，该方法产率低，且产物比活仅有21.8U/mg。基于基因工程制备重组酰基辅酶A氧化酶适宜用于工业制备，但受限于产物大多是包涵体表达且酶活差等因素，仍然难以实现大规模工业制备。因此，本领域尚需开发一种适宜大规模工业生产的酰基辅酶A氧化酶制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酰基辅酶A氧化酶的制备方法。

本发明的另一目的在于提供编码酰基辅酶A氧化酶的多核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供与编码酰基辅酶A氧化酶的多核苷酸序列适配的载体。

本发明的另一目的在于提供含有编码酰基辅酶A氧化酶的多核苷酸序列的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种编码酰基辅酶A氧化酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；

(ii)与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。

本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

本发明第四方面提供了一种制备酰基辅酶A氧化酶的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

分离所述目的蛋白，即得所述酰基辅酶A氧化酶；