[发明专利]一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法

说明书

本发明涉及一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法，包括以下步骤：加样，取猴血清样品20.0μL，置于2.0mL离心管中，加60.0μL 0.1mg/mL十二烷基磺酸钠溶液，涡流2min，加入20.0μL 50.0mM二硫苏糖醇溶液，涡流2min；还原，60℃超声30min；衍生化，冷却后加入10.0mL 250mM碘乙酰胺溶液，避光条件下低速涡流30min；蛋白沉淀，加入冷藏后的甲醇200μL，涡流10min，14000rpm，4℃，离心10min；超声酶解，取上清后丢弃，加入100μL 100mM碳酸氢铵溶液，涡流2min，加入100mL 0.500mg/mL胰蛋白酶溶液，60℃超声60min；富集浓缩，加入50.0μL含1％甲酸的乙腈溶液，涡流2min，加入200μL乙腈，涡流5min，14000rpm，4℃，离心10min，取200μL上清液到96孔板中，氮气吹干，加入100μL初始流动相复溶，涡旋混匀；仪器检测，取5μL进行LC‑MS/MS分析。本发明主要解决原有质谱检测技术灵敏度低、酶解效率低、酶联免疫技术重现性差、成本高等问题。

技术领域

本发明涉一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法。

背景技术

单克隆抗体药物具有高靶向性、高特异性、低毒性等特征，是重要的生物医药研发品种。贝伐珠单抗是全球畅销药物之一，临床用于治疗各种转移性癌症。药物研发过程中或临床药物监测时，需要测定生物基质中贝伐珠单抗的浓度。目前检测贝伐珠单抗的技术主要为酶联免疫法、液相色谱-串联质谱法。酶联免疫法灵敏度高，但其使用的试剂盒成本较高，且重现性较差。液相色谱-串联质谱法应用于贝伐珠检测时，灵敏度通常比较低。如须提高灵敏度，通常需要采用抗体亲和富集的方法，成本较高。另外，目前报道的质谱定量检测贝伐珠单抗的技术通常需要较长时间的酶解反应，因此大大降低了检测的通量。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法，包括以下步骤：

加样，取猴血清样品20.0μL，置于2.0mL离心管中，加60.0μL 0.1mg/mL十二烷基磺酸钠溶液，涡流2min，加入20.0μL 50.0mM二硫苏糖醇溶液，涡流2min；

还原变构，60℃超声30min；

衍生化，冷却后加入10.0mL 250mM碘乙酰胺溶液，避光条件下低速涡流30min；

蛋白沉淀，加入冷藏后的甲醇200μL，涡流10min，14000rpm，4℃，离心10min；

超声酶解，取上清后丢弃，加入100μL 100mM碳酸氢铵溶液，涡流2min，加入100mL0.500mg/mL胰蛋白酶溶液，60℃超声60min；

富集浓缩，加入50.0μL含1％甲酸的乙腈溶液，涡流2min，加入200μL乙腈，涡流5min，14000rpm，4℃，离心10min，取200μL上清液到96孔板中，氮气吹干，加入100μL初始流动相复溶，涡旋混匀；

仪器检测，取5μL进行LC-MS/MS分析，其中，

仪器检测中的色谱条件，采用Eclipse Plus C18色谱柱，梯度洗脱，流速200μL/min，柱温50℃，进样量5μL，流动相A为0.5mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流动B中含有0.1％甲酸；

仪器检测中的质谱条件，电喷雾电离源，电压为5500V；离子源温度为550℃；Gas1、Gas 2、Curtain Gas压力分别为60、80和25psi，扫描模式为+MRM，监测离子反应分别为：贝伐珠单抗特征肽段FTFSLDTSK m/z 523.2→m/z 797.4，CE为23eV；DP为100V，扫描时间为300ms。