[发明专利]免疫磁分离结合实时荧光定量PCR的检测方法及其在食源性致病菌快速检测中的应用

说明书

本发明公开了免疫磁分离结合实时荧光定量PCR的检测方法及其在食源性致病菌快速检测中的应用，包括：(1)免疫磁珠制备：用无菌PBS洗涤羧化MNPs，然后在含有EDC和NHSS的无菌PBS中，以激活羧基去除多余的活化试剂；将PEI加入活化MNPs中，偶联；去除多余PEI；清洗并再次悬浮PBS中；(2)将菌液与PEI‑MNPs混合，孵育，形成细菌‑PEI‑MNPs复合物；(3)然后将上清液和细菌‑PEI‑MNPs复合物分别在相应平板上培养，进行细菌计数；(4)目的基因提取后，采用实时荧光定量PCR。可以将食品中的致病菌非特异性富集出来，方便后续检测；实时荧光定量PCR相比较于普通PCR检测灵敏度更高，特异性好；本发明的方法能够应用于食源性致病菌的快速检测。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别涉及免疫磁分离结合实时荧光定量PCR的检测方法及其在食源性致病菌快速检测中的应用。

背景技术

食源性致病菌污染是引起的食品安全问题的主要来源之一。在国标中，许多食源性致病菌是零检出的标准，为了有效降低食源性致病菌的危害，提高食源性致病菌的检测灵敏度尤为重要。在食品中，对食源性致病菌进行敏感和快速筛选保障食品安全是至关重要的。

聚合酶链反应(PCR)及其衍生物是广泛应用于细菌鉴定和检测的方法，包括实时荧光定量PCR、多重PCR(mPCR)和数字PCR。然而，虽然PCR方法能够以高灵敏度的鉴定和分析多种致病菌，但仍需要长时间的预富集过程，不适用于细菌感染的快速筛选和诊断。为了提高检测灵敏度，缩短筛选时间，改进低水平目标致病菌的采样技术，减少或消除食品基质中的干扰成分尤为重要。

基于磁性纳米颗粒(MNPs)的富集策略可以有效地从复杂样品中分离出目标。其中，免疫磁富集策略由于其特异性高的优点而被广泛用于病原体分离。然而抗体的昂贵、不稳定和难以储存的特性限制了它们在欠发达地区的应用。因此，许多低成本、稳定的抗体替代品已经被开发出来，用于同时识别和分离多种细菌，如抗生素、凝集素、适配体和聚合物。研究表明，细菌表面富含脂多糖、磷壁酸等成分，使细菌表面产生带负电荷的。在许多细菌识别试剂中，聚合物是一类可以定制为包含不同官能团的合成试剂。因此，用带正电荷的聚合物修饰的MNPs可以通过静电相互作用与细菌表面结合。与其他相互作用模式相比，基于电荷的相互作用通常具有更快的响应速度和更广泛的目标结合能力。

因此开发一种提高实时荧光定量PCR分析的灵敏度的致病菌快速检测方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种免疫磁分离结合实时荧光定量PCR的检测方法，包括：

(1)免疫磁珠制备：用无菌PBS洗涤羧化MNPs，然后在含有EDC和NHSS的无菌PBS中重悬1小时，以激活羧基去除多余的活化试剂；将PEI加入活化MNPs中，偶联；去除多余PEI；清洗并再次悬浮PBS中；

(2)将菌液与PEI-MNPs混合，孵育，形成细菌-PEI-MNPs复合物；

(3)然后将上清液和细菌-PEI-MNPs复合物分别在相应平板上培养，进行细菌计数；

(4)目的基因提取后，采用实时荧光定量PCR。

本发明还提供了一种免疫磁分离结合实时荧光定量PCR的检测方法在食源性致病菌快速检测中的应用，菌液是采样的液体；或采样后稀释的液体；或采样后进行培养得到的液体。在具体采样时，采样的液体，例如，冷库中材料(肉)解冻后渗出的液体，冷库冰渣等融化的水等；采样后稀释的液体，例如，采用的可溶性固体粉末、可溶性颗粒加水溶解稀释的液体。

本发明的有益效果：磁珠表面连接聚乙烯亚胺(PEI)成本低、富集率高，可以将食品中的致病菌非特异性富集出来，方便后续检测；实时荧光定量PCR相比较于普通PCR检测灵敏度更高，特异性好；目前基于免疫磁珠富集金黄色葡萄球菌，免疫磁珠更多的是偶联抗体、成本高，不稳定，本发明的方法能够应用于食源性致病菌的快速检测。