[发明专利]一种重组蛋白及其制备方法和在牛结核病检测中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，提出了一种重组蛋白及其制备方法和在牛结核病检测中的应用，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述重组蛋白的基因的核苷酸序列如如SEQ ID NO.2所示。所述重组蛋白由ESAT‑6、CFP‑10和BFH用Linker按照ESAT‑6‑CFP‑10‑BFH的方式串联组合得到。通过上述技术方案，解决了现有技术中EC法检测牛结核病时灵敏度低的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种重组蛋白及其制备方法和在牛结核病检测中的应用。

背景技术

牛结核病是由分支杆菌属牛分支杆菌引起的一种慢性疾病，以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征，具有剧烈传染性，我国将其列为二类动物疫病。19世纪后期，科赫设计了著名的结核菌素皮肤试验，是目前被世界动物卫生组织认可的检测牛结核病的手段，在我国广泛用于牛结核病的诊断和流行病学调查，但经典的PPD（结合菌素）因所含抗原成分复杂导致特异性较差，大多数抗原为分枝杆菌属所共有，与环境分枝杆菌存在交叉反应，容易导致假阳性检测结果。其次，结核菌素作为结核分枝杆菌次级产物，生产周期至少需要6个月，且培养结核分枝杆菌需体外多次传代，可能产生菌失活、基因缺失、遗传背景不清楚等现象，导致不同批次结核菌素检测效力不均一，这些因素都可能影响结核菌素皮肤试验的检测结果。

随着时代的进步，结核菌素的生产工艺不断优化，增加了产量的同时也保证了产品的稳定性，但结核菌素的本质没有变，其中依然含有200多种抗原，导致其诊断的特异性较差，大多数抗原为卡介苗所共有，不能够区分出是自然感染牛还是卡介苗接种牛，从而严重干扰牛结核病阳性结果的判定，而卡介苗在世界范围内广泛接种，这一举措会干扰了结核菌素皮肤试验的检测，导致检查出假阳性的动物被淘汰，对养殖户造成严重的经济损失。

结核菌素至今已有近百年的历史，随着对结核病的不断深入，天然CFP10和ESAT6蛋白具有较强的细胞免疫活性。有文献报道ESAT-6、CFP-10具有高度保守性，并加强了这两种抗原在牛结核病诊断中的应用。其次，研究发现这两种蛋白均能诱发迟发性变态反应，具有较好的诊断潜力。更重要的是，ESAT6和CFP10基因在卡介苗基因中缺失，使用这两种蛋白可以区分结核分支杆菌感染还是卡介苗株感染，在体外诊断中具有较高的特异性，与结核菌素相比特异性高达93%，但灵敏度只有73%，导致ESAT6-CFP10重组蛋白（即EC）检测牛结核病的效果不理想。

目前，国内也有发现用EC法进行的检测产品，即重庆智飞生物的“宜卡”，应用的是重组蛋白ESAT6-CFP10，用于人的结核分枝杆菌感染的检测。此产品将结核分枝杆菌早期分泌性低分子量蛋白ESAT6和CFP10融合在一起，通过原核表达系统表达了重组蛋白ESAT6-CFP10。此产品只是表达了重组蛋白ESAT6-CFP10，但未解决其灵敏度低的问题，ESAT-6和CFP-10两种蛋白对牛结核病的检测效果依旧次于结核菌素。

发明内容

本发明提出一种重组蛋白及其制备方法和在牛结核病检测中的应用，解决了现有技术中EC法检测牛结核病时灵敏度低的问题。

本发明的技术方案如下：

本发明提出了一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提出了一种编码所述重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

作为进一步的技术方案，所述重组蛋白包括串联组合的ESAT-6、CFP-10和BFH。

作为进一步的技术方案，所述ESAT-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CFP-10的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述BFH的氨基酸序列SEQ ID NO.5所示。

作为进一步的技术方案，所述ESAT-6、CFP-10和BFH用Linker按照ESAT-6-CFP-10-BFH的方式串联组合，所述Linker的氨基酸序列SEQ ID NO.6所示。