[发明专利]重组酶介导的全冻干恒温扩增体系及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组酶介导的全冻干恒温扩增体系及其制备方法和应用，涉及分子生物学检测领域，本发明全冻干恒温扩增体系包括两部分：第一部分为酶体系；第二部分为引物探针和激活体系；所述酶体系的冻干形式为冻干粉；所述引物探针和激活体系的冻干形式为冻干球。本发明通过将酶体系制备成冻干粉，将激活体系和引物探针混合制备成冻干球，提高了液体顺滑度和均质性，避免了冻干过程中全体系粘稠度高不易分散匀浆，导致结果不稳定的问题，实现了RPA全冻干，达到一步上样的操作，操作便利。本发明中包含所述全冻干恒温扩增体系的试剂盒灵敏度和特异性高。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种重组酶介导的全冻干恒温扩增体系及其制备方法和应用。

背景技术

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃-40℃左右。RPA反应速度快，用时短，特异性强。目前，RPA试剂可以以冻干粉或液体的形式保存，其中，将RPA试剂冻干预分装可以避免反复冻融导致的实验结果误差，防止酶等粘度高的组分损耗，能够常温储运，包装形式简单。

然而，由于RPA体系依赖于扩增酶及蛋白的作用，而体系中酶与蛋白在常温即可反应，为确保体系能够长期保存且保有较佳的活性，试剂的存在形式和保存条件至关重要。整个RPA恒温扩增酶体系需要激活剂激活反应，来促进多酶体系的工作，如聚乙二醇具有提高RPA扩增反应的效率，促进DNA链的合成，协助重组酶与单链蛋白功能之间的平衡等功能；金属镁离子能够促进DNA聚合酶与dNTP的结合，进入体系即开始扩增反应，促进DNA链的合成。目前较为常见的重组酶恒温扩增技术的商业体现形式为冻干+液体试剂组合(半冻干形式)，即只冻干对温度敏感的反应酶体系，将对温度耐受性高的激活体系设置为液体型试剂，常见保存于-20℃。另外还有全液体形式试剂，即所有组分均为液体，但对保存条件要求较高，需要严格保存于-20℃。但以上两种试剂形式，均存在操作较为复杂的问题。半冻干试剂在使用过程中，需要使用冻干重建剂/复融剂和激活剂作为反应必要成分，存在3次点样的步骤，且激活剂的加入量为2-3μL/孔，对实验人员和操作工具的要求较高，流程繁琐，容易导致点样误差；而在重组酶介导的恒温扩增体系中，常见的作为液体形式存在的复融剂和激活剂对体系的激活作用是即时的，即在酶体系与激活体系混合后，在常温即刻开始反应，因此在前期测试中，单纯的混合全体系后进行冻干的效果并不可观，且聚乙二醇粘稠度较高，影响全体系的均质性。

中国专利CN110305975B公开了一种快速检测鸡滑液囊支原体的RPA试剂盒及其用途，该试剂盒包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液，醋酸镁，一对引物及一条探针。该试剂盒仅将扩增所需要的酶和其他一些必要的东西已经冻干保存，扩增时仍需要加入反应缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应，反应步骤繁琐，不方便运输及保存。

当前缺少一种能够更灵敏、更高特异性，满足快速检测需求并且全冻干的恒温扩增体系。

发明内容

除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。通过端点表述的数值范围包括在对应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种重组酶介导的全冻干恒温扩增体系及其制备方法和应用，该全冻干恒温扩增体系由三部分组成，分别为酶体系冻干粉、激活体系冻干球和引物探针冻干球，三部分的冻干形式不同，能够提高液体顺滑度和均质性，避免了冻干过程中全体系粘稠度高不易分散匀浆，导致结果不稳定的问题，实现了RPA全冻干，达到一步上样的操作。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种全冻干恒温扩增体系，包括两部分：