[发明专利]一种提升梭菌气体发酵性的方法及应用

权利要求书

1.一种提升梭菌气体发酵性的方法，其特征在于：所述的梭菌为Clostridiumljungdahlii，源于德国国家培养物保藏中心DSMZ的永达尔梭菌标准株，保藏号为DSMNO.13528；

S1：过表达质粒的构建，在永达尔梭菌中过量表达了基因CLJU_c18450，过量表达基因CLJU_c18450的质粒P_pta-18450，所采用的质粒骨架为pMTL83151，所使用的驱动基因表达的启动子为P_pta；具体操作过程如下：以上述永达尔梭菌标准株基因组为模板，使用PCR方法扩增基因CLJU_c18450，引物为18450-F和18450-R，同时使用引物P_pta-F和P_pta-R扩增启动子P_pta，随后，以PCR扩增的产物CLJU_c18450和P_pta同时作为模板，使用引物P_pta-F和18450-R，再次通过PCR扩增得到DNA片段P_pta-18450，接着，用Thermo快切酶XbaI和BamHI双酶切质粒骨架pMTL83151，由于上述扩增获得的DNA片段P_pta-18450与酶切的质粒骨架之间存在大于21bp同源序列，二者可通过同源重组酶生成环状的P_pta-18450质粒，后者经转化进入大肠杆菌感受态细胞TOP10，并涂布于含有氯霉素的固体培养基上进行培养，24h长出的单菌落即为含有P_pta-18450质粒的大肠杆菌转化子，

所用引物序列如下：

18450-F：

5’TAAATTTAAAGGGAGGAAATGAACatgaataaaactcaaaatacatttataa catcaag3’；

18450-R：

5’tggacgcgtgacgtcgactctagattattttttttcaaaactaccacctttt ttaaaag3’；

P_pta-F：

5’cgaattcgagctcggtacccggggatccAGAAATTTTCCTTTCTAAAATATT TTATTCC3’；

P_pta-R：

5’GTTCATTTCCTCCCTTTAAATTTAAC3’；

S2：永达尔梭菌电转感受态制作，将保藏在甘油中的永达尔梭菌接种到液体培养基中，进行活化培养，待种子液0D₆₀₀达到0.8-1.0时，用接种环蘸取少量菌液，在固体培养基上划线，厌氧培养，挑取平板上长出的单菌落，将其接种到5mL液体培养基中，待其长至OD₆₀₀为0.8-1.0时，以5％(v/v)接种量将菌液转接到200mL液体培养基中扩大培养，后者长至0D₆₀₀为0.4-0.5时，加入蔗糖溶液和甘氨酸溶液，处理2h将其置于冰上20min，并离心收集菌体，去除上清液，用事先预冷的缓冲液洗涤菌体2-3次，随后完全倒弃上清液，最后，用2-3mL缓冲液重悬菌体，并将其存放于-80℃备用；

S3：永达尔梭菌电穿孔转化，构建的质粒P_pta-18450通过电穿孔转化的方法导入到永达尔梭菌标准株中。

2.根据权利要求1所述的一种提升梭菌气体发酵性的方法，其特征在于，所述永达尔梭菌电穿孔的步骤为；取4μg质粒与200μL感受态混匀，冰上孵育10min，然后转移到预冷的2mm电转杯中，将盛有混合液的电转杯置于电转仪，电击，然后迅速加入800μL液体培养基作为复苏液，复苏6-20h，之后涂布于带有氯霉素抗性的固体培养基上，厌氧培养3-4天后，固体培养基上长出的菌落获得工程菌株。

3.根据权利要求2所述工程菌株利用CO₂、CO及H₂合成乙醇的应用。