[发明专利]一种提升梭菌气体发酵性的方法及应用

说明书

本发明涉及代谢工程菌的技术领域，尤其涉及一种提升梭菌气体发酵性的方法及应用，通过在质粒Ppta‑18450上过量表达CLJU_c18450，利用电穿孔转化将构建的质粒Ppta‑18450通过电穿孔转化的方法导入到永达尔梭菌标准株中。本发明通过以上设计，可可提高梭菌的COsubgt;2/subgt;/CO的利用能力以及产物合成能力。

技术领域

本发明涉及代谢工程菌的技术领域，尤其是涉及一种提升梭菌气体发酵性的方法及应用。

背景技术

一碳气体如二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO)可以被微生物吸收利用，在缓解环境问题的同时生成高值化学品带来经济效益。工业排放的合成气是二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO)的主要来源之一，合成气主要包含CO、CO₂、H₂等气体，这些气体可以作为食气梭菌自养生长的原料。其中，CO和CO₂可以作为碳源，而H₂可以作为能源被利用。

产乙酸菌是一类专性厌氧菌，因具有独特的Wood-Ljungdahl(WL)途径(又称还原性乙酰辅酶A途径)来固定CO₂或其它一碳底物而受到关注。梭菌是这类微生物中最主要的成员，可以利用含碳气体实现菌体的快速繁殖，且具备很强的乙醇和丁醇生产能力，因而是理想的CO/CO₂生物转化微生物。其中，永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)是其中最受关注的一员，能够高产乙醇、丁酸、异丙醇、异戊二酸等化合物。

然而，永达尔梭菌天然的WL途径效率低下，亟待开发性能更优的C.ljungdahlii用于气体发酵和转化利用。通过代谢工程改造永达尔梭菌是实现上述目标的有效手段。

然而，由于永达尔梭菌作为严格厌氧细菌培养较为困难，且其强大的限制性修饰系统能够对外来的DNA进行高效的降解，因此造成外源DNA转化永达尔梭菌的效率很低。因此，目前对该菌进行遗传操作较为困难，造成相关的研究进展缓慢。

发明内容

为了解决上述背景技术中提出的技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种提升梭菌气体发酵性的方法，可提高梭菌的CO₂/CO的利用能力以及产物合成能力。

本发明采用如下技术方案：

一种提升梭菌气体发酵性的方法，所述的梭菌为Clostridium ljungdahlii，源于德国国家培养物保藏中心DSMZ的永达尔梭菌标准株，保藏号为DSM NO.13528；

S1：过表达质粒的构建，在永达尔梭菌中过量表达了基因CLJU_c18450，过量表达基因CLJU_c18450的质粒P_pta-18450，所采用的质粒骨架为pMTL83151，所使用的驱动基因表达的启动子为P_pta；具体操作过程如下：以上述永达尔梭菌标准株基因组为模板，使用PCR方法扩增基因CLJU_c18450，引物为18450-F和18450-R，同时使用引物P_pta-F和P_pta-R扩增启动子P_pta，随后，以PCR扩增的产物CLJU_c18450和P_pta同时作为模板，使用引物P_pta-F和18450-R，再次通过PCR扩增得到DNA片段P_pta-18450，接着，用Thermo快切酶XbaI和BamHI双酶切质粒骨架pMTL83151，由于上述扩增获得的DNA片段P_pta-18450与酶切的质粒骨架之间存在大于21bp同源序列，二者可通过同源重组酶生成环状的P_pta-18450质粒，后者经转化进入大肠杆菌感受态细胞TOP10，并涂布于含有氯霉素的固体培养基上进行培养，24h长出的单菌落即为含有P_pta-18450质粒的大肠杆菌转化子，

所用引物序列如下：