[发明专利]一种简便的可视化快速核酸检测方法及其应用

说明书

本发明提供一种简便的可视化快速核酸检测方法及其应用，所述方法采用以下检测体系，包括：(1)PMNT；(2)Cas12a蛋白；(3)crRNA；(4)报告分子；将待测样本加入该检测体系中，通过溶液在自然光下的颜色变化实现一种可视化快速核酸检测：当报告分子被Cas12a蛋白切割，溶液呈现黄色，表示待测样本中存在对应的靶标核酸分子；当报告分子不被Cas12a蛋白切割，溶液呈现红色，则表示待测样本中不存在对应的靶标核酸分子。本发明弥补了现有CRISPR检测技术的不足，具有无需荧光标记、无需荧光设备、检测结果易判定等优点，在环境监控、食品安全、医疗、动植物传染病防控等领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种简便的可视化快速核酸检测方法及其应用。

背景技术

快速、精准和高效的核酸分子检测技术在环境监控、食品安全、医疗、动植物传染病防控等诸多领域都发挥重要的作用。基于CRISPR/Cas系统结合现有的分子生物学技术在核酸分子检测上可达到埃摩级，单碱基分辨、现场可测的简单灵活方法展示出巨大应用潜力。相较于传统的PCR核酸检测技术，目前CRISPR检测技术发展迅速，但此类方法主要依靠荧光信号来判定检测样品中靶标核酸分子的浓度，检测时依然需借助相关仪器设备，而且要求检测人员对荧光信号强弱判定具有一定的经验，这限制了其开展现场快速检测的需求。因此，迫切需要开发一种快速灵敏、高特异性、无需荧光设备、裸眼可视化、易于判定结果的现场快速检测靶标核酸的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便的可视化快速核酸检测方法及其应用，从而解决现有技术中CRISPR检测方法需借助相关仪器设备，而且要求检测人员对荧光信号强弱判定具有一定的经验，因此导致无法开展现场快速检测的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种简便的可视化快速核酸检测方法，所述可视化快速核酸检测方法采用以下检测体系，包括：(1)PMNT，或者与PMNT相似的和单链核酸混合会发生颜色变化的聚合物；(2)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a类似的反式单链DNA切割活性的Cas蛋白；(3)crRNA，所述crRNA引导Cas12a蛋白特异性与靶标核酸分子结合；(4)报告分子，所述报告分子是ssDNA分子，可与PMNT结合，使溶液显现红色，当所述报告分子被所述Cas12a蛋白反式切割后，使溶液呈现黄色；其中，将待测样本加入所述检测体系中，通过溶液在自然光下的颜色变化实现一种可视化快速核酸检测：当报告分子被Cas12a蛋白切割，溶液呈现黄色，表示所述待测样本中存在对应的靶标核酸分子；当报告分子不被Cas12a蛋白切割，溶液呈现红色，则表示待测样本中不存在对应的靶标核酸分子。

PMNT，聚[3-甲基-4-(3-(N,N,N-三乙基铵基)丙氧基)-2,5-噻吩]，是一种和单链核酸混合会发生颜色变化的水溶性噻吩类共轭聚合物。可选地，所述与PMNT相似的和单链核酸混合会发生颜色变化的聚合物为聚(9,9-二正辛基芴基-2,7-二基)，应当理解的是，聚(9,9-二正辛基芴基-2,7-二基)具有与PMNT相似的性质，因此该聚合物同样适用于本发明。

所述ssDNA分子的结构为N_m，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基；m为14～18的正整数，其中，最优选为15。

在所述检测体系中，ssDNA分子的浓度为1～10μM，其中，最优选为2.5～5μM。

在所述检测体系中，所述PMNT的浓度为25～100μM，其中，最优选为50～100μM。

根据本发明的一个实施例，采用30μL检测体系，其组成为：1X NEBuffer，30nMcrRNA，30nM EnGen Lba Cas12a，1.3U/μL RNase inhibitor，1～10μMssDNA-15nt，30nM待测DNA，25～100μM PMNT。