[发明专利]重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量测定方法及检测试剂盒

权利要求书

1.重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量检测方法，包括如下步骤：

(1)使用约4至5mL容量的细胞培养瓶，例如T25培养瓶，培养细胞；

(2)将以下各组接种物加入至分别的所述细胞培养瓶中，进行细胞的第一轮感染：

i)阳性对照组(PC)：为辅助病毒和rcAAV标准品，其中，辅助病毒用于rcAAV标准品的复制，且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV，例如，1E+4vg，2E+4vg，4E+4vg，6E+4vg，8E+4vg，1E+5vg，2E+5vg rcAAV；

ii)加标组(Spike)：为辅助病毒和rcAAV标准品，以及受检样品，其中，辅助病毒用于rcAAV标准品的复制，且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV，例如，1E+4vg，2E+4vg，4E+4vg，4E+4vg，6E+4vg，8E+4vg，1E+5vg，2E+5vg rcAAV；受检样品为约1E+08vg至1E+11vgAAV，例如，1E+08vg，1E+09vg，1E+10vg，1E+11vg AAV；

iii)受检样品组(Test)：为辅助病毒和受检样品，其中，受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV，例如，1E+08vg，1E+09vg，1E+10vg，1E+11vg AAV；

(3)第一轮感染结束后，将所述各培养瓶中的细胞及上清冻融，并将各培养瓶中的全部细胞及上清转移至分别的离心管中，56℃灭活后，超滤浓缩至1mL；取约500μL浓缩液于≤-70℃保存，用于qPCR检测；另约500μL浓缩液作为下一轮感染接种液；

(4)将第一轮感染后获得的各约500μL浓缩液加入约4mL新鲜的培养基中，进行第二轮细胞感染，与步骤(3)同样地，各培养瓶获得1mL超滤浓缩液，全部用于下一轮感染；

(5)第三轮感染(任选地，第四轮感染)与第二轮感染操作相同；在第三轮感染(任选地，第四轮感染)结束后，各培养瓶获得1mL超滤浓缩液全部用于qPCR检测；

(6)完成三轮(任选地，四轮)感染后，自第一轮和最后一轮感染收获的超滤浓缩液提取DNA，作为实施qPCR的DNA模板，以Rep基因为模板设计特异性引物以及Taqman探针，进行qPCR检测；

(7)结果分析及判定：

如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值；

加标组(Spike)：第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值；

且受检样品组(Test)：第一轮Ct均值＜最后一轮Ct均值，则受检样品中rcAAV含量为：＜rcAAV标准品加入量/AAV样品加入量(vg)；

如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值；

加标组(Spike)：第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值；

且受检样品组(Test)：第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值，则需进一步稀释受检样品并实施步骤(1)至(6)的检测，直至检测到受检样品组(Test)：第一轮Ct均值＜最后一轮Ct均值，则受检样品中rcAAV含量为：rcAAV标准品加入量/稀释的AAV样品加入量(vg)。