[发明专利]重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量测定方法及检测试剂盒

说明书

本发明涉及重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量的检测方法，所述方法的特征在于：使用4至5mL容量的细胞培养瓶培养细胞并在不损失rcAAV的情形下对细胞进行三轮或以上感染，然后使用SEQ ID NO:1和2所示的rep2基因特异性引物和SEQ ID NO:3所示的Taqman探针对第一轮和最后一轮的感染收获的超滤浓缩液实施定量PCR检测，由此获得重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量。本发明还涉及用于实施本发明的重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量的检测方法的试剂盒。

技术领域

本发明涉及重组腺相关病毒载体制品的质量检测领域。具体而言，本发明涉及重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体制品中rcAAV含量的测定方法以及用于测定rcAAV含量的检测试剂盒。

背景技术

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体无致病性，免疫原性低，安全性好，能转导种类众多的组织细胞，并能长期稳定地表达其携带的基因，这些特性使其十分适合于作为体内基因转移的工具。重组腺相关病毒(recombinant AAV，rAAV)载体是一种具有高靶向性和良好安全性的病毒载体，在基因治疗中得到了较为广泛的应用。

目前构建重组AAV载体通常使用目的基因替换野生型腺相关病毒基因组中的rep基因、cap基因，再将重组基因组包装到有感染性的病毒颗粒中。重组AAV载体通过AAV ITR与反式存在于辅助成分或生产细胞中的rep基因和cap基因序列之间的同源或非同源重组的机制，在重组AAV载体生产期间可能形成复制型腺相关病毒(Replication CompetentAAV,rcAAV)。近期的动物实验表明，rcAAV中cap基因在体内的表达会引发严重的免疫反应，且包装有其他DNA杂质的rcAAV还具有致瘤性或引入抗生素抗性的潜在风险。因此，重组AAV载体生产的组件应设计为可以消除rcAAV产生的可能，并且临床使用的rAAV载体产品需要对rcAAV进行检测，以严格控制rAAV载体制品中rcAAV的污染。

rcAAV作为rAAV载体制品生产过程中的产品相关杂质，对其限度尚未有明确的标准要求。重组AAV-2/人凝血因子IX注射液质量标准中规定：在1E+06vg的rAAV-hFIX中，rcAAV颗粒数(即，基因组拷贝数)不超过1个，检测方法为PCR法(《生物技术药物研究开发和质量控制(第三版)》)。

随着基因治疗技术的发展，研究者开发出qPCR法检测rcAAV基因组拷贝数，但是qPCR法扩增的rcAAV基因组不一定具有复制或感染活性。因此qPCR法无法真正的确定rcAAV含量。此外，qPCR法检出限受rAAV制品浓度限制，无法检测低浓度rAAV制品中残余rcAAV基因组拷贝数，例如用于生产过程中对中间产品的质量控制。

对于AAV2血清型载体，可以使用感染中心测定法(infectious center assay)进行具有复制活性的rcAAV残余检测。由于大多数非AAV2血清型载体制品中的rcAAV观察到对于体外培养细胞的感染效率较低，开发非AAV2血清型载体制品中的rcAAV测定是一个挑战。