[发明专利]一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法

说明书

本发明提供一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，所述方法包括如下步骤：将枯草三十七肽的发酵菌种枯草芽孢杆菌经复壮活化、一级种子、二级种子、30 L种子罐、3 m³种子罐、30 m³发酵罐发酵、在30 m³发酵过程中添加补料、放罐。在产枯草三十七肽前期分段补料，可以避免枯草芽孢杆菌过度生长，减少分泌其他代谢产物；在产枯草三十七肽中期与末期分段补料可以满足枯草芽孢杆菌产枯草三十七肽的营养需要。采用本发明的方法进行枯草三十七肽的生产，可以提高发酵液中枯草三十七肽的含量，缩短发酵时间，提高生产效率。

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

背景技术

抗菌肽( Antimicrobi al peptides， AMPs)是生物进化上最古老的抗微生物感染多肽，是从原核生物到人等各种生物先天性免疫调节的重要组成部分，是具有直接抗菌和菌群调节作用的固有免疫效应分子。在历史上，最先认识到抗菌肽的抗菌功能，因此最先将其命名为抗菌肽。随着对该类物质结构和功能的逐步深入认识，近年来已经发现抗菌肽在调节机体免疫应答方面有着非常重要的作用，很多抗菌肽是先天性免疫和获得性免疫的桥梁。抗菌肽通过直接杀菌/抑菌作用和提高机体免疫应答水平而发挥其抗感染作用，这是抗菌肽优于抗菌素之处。因此，目前又将抗菌肽称为免疫防御肽。

目前的研究表明，抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原虫、调节机体免疫力等活性，并且不容易产生耐药性。抗菌肽具有多种免疫调节作用，包括调节炎症反应、趋化免疫细胞、促进细胞分化、激活先天性和获得性免疫系统等。抗菌肽的多种免疫调节特性使得其有望成为治疗感染疾病和免疫疾病的药物。

枯草三十七肽的英文名称为Subl ancin，由37个氨基酸残基组成，分子量为3879.8 D a（按2018年国际相对原子质量），结构中由五个半胱氨酸形成两个二硫键，结构稳定，对高温、酸碱、胃蛋白酶具有良好的抵抗力；实验表明，枯草三十七肽能够增强巨噬细胞R AW264.7的吞噬功能。临床试验表明， 枯草三十七肽能够增强畜禽及水产动物的免疫功能，提高疫苗的免疫效果，安全性高，无药物残留。

国内外对枯草三十七肽也有一些研究，1998年，P aik SH等对枯草芽孢杆菌168产生的枯草三十七肽的化学和生物学结构特征及转运蛋白基因的鉴定进行了研究，得出枯草三十七肽是由37个氨基酸残基组成的多肽，含有两个二硫键，其水溶液在室温条件下存放两年，没有发生降解和失活，可见其比较稳定。枯草三十七肽虽具有很好的替代传统抗生素的潜力，但枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量很低，不能满足大规模使用的需求。所以，国内外学者一直致力于提高枯草三十七肽产量的研究，Shengyue Ji等通过引入三个特异性启动子，重组枯草芽孢杆菌的操纵子，来提高枯草三十七肽的产量，最终使重组枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量提高到642 mg/L。姬生妖在5 L发酵罐中，采用筛选到的最优培养条件对重组菌株进行培养，枯草三十七肽的产量被进一步提高到968 mg/L。也有专利CN 112029697通过重组枯草芽孢杆菌JY011802发酵将枯草三十七肽的产量提高到3100mg/L。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中利用枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量低，不能满足大规模使用的需求。

为解决该技术问题，本发明提供一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，所述方法包括如下步骤：将枯草三十七肽的发酵菌种枯草芽孢杆菌经复壮活化、一级种子、二级种子、30 L种子罐、3 m³种子罐、30 m³发酵罐发酵、在30 m³发酵过程中添加补料、放罐：

（1）枯草芽孢杆菌的活化：从-80 ℃取出枯草芽孢杆菌菌种，复温后，采用划线接种到营养肉汤琼脂平板上，35 ℃培养12小时；

（2）一级种子：从平板上，挑取单个菌落，接种于一级种子培养基中，装量30 mL/150 mL，于180 r/min摇床中37℃培养6～8 h，测定发酵液的OD值，达到1.6～1.8后，得到一级种子液；