[发明专利]一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒

权利要求书

1.一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：

步骤一，提取人肌肉组织总RNA及获得总cDNA

从临床中获取人肌肉组织，采用TRIzol试剂提取RNA，在多功能酶标仪上检测RNA浓度及纯度，用DEPC处理水校正零点；用DEPC处理水稀释RNA样品；读取OD260、OD280值和OD260/OD280的比值，当OD260/OD280的比值范围在1.8-2.0时，进行反转录反应，获取cDNA；

步骤二，构建重组表达pSJMY-NT5C1A-GFPC载体

根据NT5C1A序列设计NT5C1A基因扩增引物，利用已设计合成好的引物进行RT-PCR获取人NT5C1A基因，将RT-PCR扩增产物NT5C1A与T载体进行TA克隆，将大小位置正确的转化子接菌，培养，提取质粒，限制性酶切及测序鉴定，挑选正确的转化子进行重组组合，从T载体上切胶回收，插入到C端含有GFP绿色荧光标签的空载体pSJMY-GFPC、连接或者直接做无缝克隆，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，以上下游引物对转化子进行菌落扩增，培养重组克隆成功的转化子，提取质粒，进一步通过目的基因PCR、限制性酶切、基因测序等方式对重组质粒进行鉴定，选择正确的载体进行质粒的大量提取，保菌；

步骤三，制备含重组表达载体pSJMY-NT5C1A-GFPC的细胞

接种HEK293T细胞至24孔培养板及腔室载玻片系统培养24h，当细胞达80％融合时采用Turbo8.0转染试剂进行转染，分别将pSJMY-NT5C1A-GFPC载体与转染试剂按照质量体积比0.1ug:0.3ul转入HEK293T细胞，放至CO₂培养箱培养48h后，荧光显微镜下观察转染效率并记录、拍照，当转染效率达到60%-80%，将转染细胞弃上清，使用PBS清洗一遍细胞，弃PBS，用多聚甲醛固定细胞20min后，再使用PBS清洗2遍，加入含Triton、BSA进行破膜及封闭3小时至过夜，从而得到通透的含重组表达载体pSJMY-NT5C1A-GFPC的细胞

步骤四，构建并验证CBA间接免疫荧光法

构建步骤：

a.将兔源一抗按照1：400-1:1000的比例进行稀释；

b.转染细胞表面封闭液弃去，加入稀释后的兔源一抗，37℃环境下孵育30min-2h；

c.用含Triton的PBS洗液洗涤；

d.加入Alexa Fluor® 594二抗，孵育30min-2h；

e.含Triton的PBS洗液洗涤；

f.加入一定体积的磷酸盐缓冲液进行免疫荧光观察，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光分别进行观察拍照；

g.对转染细胞提取全蛋白，进行蛋白免疫印迹实验，验证重组表达载体在细胞中NT5C1A蛋白表达情况，

步骤五，筛选应用于临床血清标本NT5C1A抗体

通过步骤四构建的CBA间接免疫荧光法测定人血清中的抗NT5C1A抗体情况，根据免疫荧光图进行临床阳性判定，具体步骤为：

a.获取临床患者的血清样本，并对血清标本进行比例稀释，

b.弃去转染细胞表面封闭液，加入稀释后的血清样本，37℃环境下孵育30min-2h；

c.用含Triton的PBS洗液洗涤；

d.加入Alexa Fluor® 594二抗，孵育30min-2h；

e.含Triton的PBS洗液洗涤；

f.加入一定体积的磷酸盐缓冲液进行免疫荧光观察，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光分别进行观察拍照，获取免疫荧光图；

g.根据免疫荧光图的显色情况进行临床阳性判定，判定方法为：pSJMY-NT5C1A-GFPC转染HEK293T细胞后，GFP和NT5C1A融合显示绿色荧光，抗NT5C1A血清抗体与转染的NT5C1A蛋白结合，在Alexa Fluor® 594二抗作用下，显示红色荧光，若绿色荧光和红色荧光Merge后荧光呈黄色，则证明抗体阳性，否则为阴性。