[发明专利]一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒

说明书

本发明公开了一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒，所述的检测方法包括提取人肌肉组织总RNA及获得总cDNA、构建重组表达pSJMY‑NT5C1A‑GFPC载体、制备含重组表达载体pSJMY‑NT5C1A‑GFPC的细胞、构建并验证CBA间接免疫荧光法和筛选应用于临床血清标本NT5C1A抗体等步骤。本发明提出一种适用于临床的抗NT5C1A自身抗体检测方法，通过构建带有荧光标签的NT5C1A真核表达载体，并利用脂质体转染的方式建立基于HEK293细胞的双色间接免疫荧光方法，制备抗NT5C1A抗体细胞，测定患者血清中抗NT5C1A抗体，可以最大限度的维持蛋白的空间构象，提高检测的特异性，对患者的早期诊断和疗效评价均有明确的指导意义，且该方法中所使用的试剂均为常规试剂，便于获得，有利于降低临床检测成本，具有显著的社会效益。

技术领域

本发明涉及NT5C1A-Ab测定技术领域，特别涉及一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒。

背景技术

特发性炎性肌病（idiopathic inflammatory myopathies,IIM）是一大类以慢性肌肉炎症为主要特征的自身免疫性疾病，临床上以四肢近端肌肉受累为突出表现，可出现肌无力、血清肌酸激酶的升高，同时血清中可出现一系列的自身抗体。除此之外，IIM患者还常出现其他重要脏器的累及，包括皮肤、肺脏、心脏、关节、消化道等，10%-40%患者可合并有恶性肿瘤，表现出强烈的异质性。IIM导致的残疾可严重影响患者的生存质量，而出现多系统受累的患者整体预后很差，研宄显示其死亡率达12%-60%，因此这一疾病也越来越受到关注。

根据临床表现和病理学特征的不同，可将IIM分为以下几大亚型：多发性肌炎（polymyositis,PM）、皮肌炎（dermatomyositis,DM）、免疫介导的坏死性肌炎（immune-mediatednecrotizing myopathy,IMNM）、非特异性肌炎（nonspecificmyositis,NSM）和包涵体肌炎（inclusion body myositis,sIBM）。这些疾病既有相同的临床表现，有各自有特殊的表型，可能与其不同的发病机制有关。近年的一些研究发现一些自身抗体与特殊的临床表型有一定的相关性，因而肌炎患者经常有与不同的临床表型相关的自身抗体。仅在肌炎患者中发现的自身抗体被称为肌炎特异性自身抗体(MSAs)，而在其他自身免疫疾病中发现的自身抗体被称为肌炎相关自身抗体(MAAs)。包涵体肌炎(IBM)是一种特发性炎症性肌病(IIM)，通常影响年龄在50岁以上的患者。IBM患者的临床特征是不对称的手指屈伸无力和膝关节伸展无力。2013年，在IBM患者的血清中检测到抗胞质5‘-核苷酸酶1A(NT5C1A)抗体，并被认为为IBM的潜在诊断标志物。自2014年以来，华盛顿大学神经肌肉临床实验室已将抗NT5C1A抗体测试纳入其肌炎分离抗体测试。2016年，研究者发现一种针对43kD蛋白的血清抗体似乎在sIBM（散发型包涵体肌炎）患者中很常见；该自身抗体可以与该蛋白NT5C1A结合，该蛋白在骨骼肌中最为丰富，可能在DNA修复中发挥作用。随后，在皮肌炎、干燥综合征和系统性红斑狼疮患者中检测到该抗体。这表明抗NT5C1A可以在除IBM以外的自身免疫性疾病中检测到。在IBM或皮肌炎中，抗NT5C1A的血清阳性与其他临床病理特征之间的关系已经被讨论，一些报道称，在IBM或幼年、青少年肌炎中，抗NT5C1A的血清阳性可以预示更严重的表型。抗NT5C1A抗体在普通人群中很少见，在除sIBM以外的炎症性肌病中出现的频率较低。抗NT5C1A抗体的致病作用尚不清楚。研究数据表明，具有NT5c1A抗体的血清阳性sIBM可能代表一种更具侵袭性的疾病，有更严重的运动和功能缺陷，球部和呼吸受累的发生率更高。

目前，对于抗NT5C1A抗体的检测多是采用WB方法，但由于其难以维持蛋白的空间构象，致使其特异性不高，且费用昂贵，时间也很长，极大的限制了这些检测手段的推广，因而建立该抗体的检测方法并研制自身免疫性脑炎抗体体外诊断试剂，对于检测患者血清中抗体对该肌病的诊断具有重要意义。为此，我们提出一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒。

发明内容