[发明专利]一种fusA基因的用途及其指示灿烂弧菌进入持留状态的方法

权利要求书

1.一种fusA基因在细菌代谢状态指示剂方面的用途，其特征在于：所述的fusA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种fusA基因指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，其特征在于包括以下步骤：设计fusA基因的上下游扩增引物，结合实时荧光定量PCR方法，若灿烂弧菌fusA基因表达量降低至活跃菌的40%及以下，即可认定灿烂弧菌进入低代谢的持留状态，其中fusA基因PCR扩增的上游引物fusAF序列为：5'-CATTCAAGAACAAGGGTG-3'；fusA基因PCR扩增的下游引物fusAR序列为：5'-CGAACGAAAGTTAGAGCA-3'。

3.根据权利要求2所述的一种fusA基因指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）收集OD₆₀₀=0.6-2.0的灿烂细菌菌液，均分成两份，一份作为活跃菌；另一份加入250μg/mL的抗生素作用4小时，12,000 g 离心5分钟收集菌体，此部分菌体即为通过降低代谢水平耐受抗生素的持留菌，使用细菌RNA提取试剂盒，提取持留菌和活跃菌中的总RNA，使用反转录试剂盒将总RNA中的mRNA反转录为cDNA；

（2）利用实时荧光定量PCR试剂盒中的试剂配制以下的反应混合液：SYBR 反应液，10 μL；10 μM fusAF引物，1 μL；10 μM fusAR引物，1 μL；cDNA模板，0.5 μL；内参染料ROX，0.5 μL；ddH₂O，7 μL；内参基因为16S rDNA，按照fusA基因扩增的方法制备内参基因的扩增反应混合液；

（3）将配制的反应混合物置于实时荧光定量PCR仪进行扩增反应：反应程序为：（1）95℃，5分钟；（2）95 ℃，30秒；（3）52 ℃，20秒；（4）72 ℃，20秒回到第（2）步进行40个循环；（5）72 ℃，10分钟，获得样本的fusA基因和内参基因的C_T值；

（4）计算基因的表达备注：采用2^-△△Ct的方法计算基因的相对表达水平：2^-△△CT=2^{-[(SfusA的CT-CfusA的CT)-(S16S的CT-C16S的CT)]}，其中S为样本菌体，C为活跃菌菌体，将活跃菌中fusA基因的表达量看作1，样本菌体中的fusA基因相对表达量低于活跃菌的40%即为阳性值，说明细菌的代谢状态进入了低代谢的持留状态。

4.根据权利要求3所述的一种fusA基因指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，其特征在于：步骤（1）中收集培养至稳定期OD₆₀₀=2.0的灿烂细菌菌液。