[发明专利]一种fusA基因的用途及其指示灿烂弧菌进入持留状态的方法

说明书

本发明公开了一种fusA基因及其指示灿烂弧菌进入持留状态的方法，特点是具有在细菌代谢状态指示剂方面的用途，fusA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，指示灿烂弧菌进入持留状态的方法包括以下步骤：设计fusA基因的上下游扩增引物，结合实时荧光定量反转录PCR方法，若灿烂弧菌fusA基因表达量降低至活跃菌的40%及以下，即可认定灿烂弧菌进入低代谢的持留状态，其中fusA基因上游引物fusAF序列为：5'‑CATTCAAGAACAAGGGTG‑3'；fusA基因下游引物fusAR序列为：5'‑CGAACGAAAGTTAGAGCA‑3'，优点是简单快速、准确判断细菌是否进入低代谢状态。

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，尤其是涉及一种 fusA基因的用途及指示灿烂弧菌进入持留状态的方法。

背景技术

持留菌是菌群中生长缓慢或暂时处于休眠状态的一小部分比例的亚群，这一小部分的菌体在宿主体内的存在是顽固性、传染性疾病复发的根源。在自然环境及生物体环境中，多种病原菌，包括结核分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌等，均可有一小部分菌体转化为持留菌。持留菌极其容易复苏，在体内抗菌药物浓度降低或机体免疫力下降时极其容易复苏为代谢活跃并具有致病力的菌株，成为多种传染性疾病复发的基础]。许多慢性反复性细菌病的治疗失败和顽固复发，例如结核分枝杆菌引起的结核病、大肠埃希氏菌引起的慢性尿路感染、伤寒沙门氏菌引起的伤寒、幽门螺杆菌引起的消化性溃疡和葡萄球菌引起的心内膜炎、骨髓炎等等均是由于病原菌进入持留状态所引起的。因此，检测细菌的代谢状态，尤其是是否处于低代谢的持留菌状态对于病害的发生和复发感染具有重要的意义。

细菌在应对不利的环境因素时，通过降低代谢进入低代谢的持留菌形式得以存活，因此任何参与细菌物质合成和能量代谢的过程都可能与持留菌形成相关，因此该过程涉及机制和系统冗繁。抑制DNA、蛋白质、细胞壁或ATP能量等合成过程的相关基因，均参与菌体持留菌的形成过程。常见的持留菌的筛选方法为采用高浓度的抗生素，一般为10倍最小抑菌浓度（10×MIC）的抗生素杀死活跃菌，耐受高浓度的抗生素的即认为是持留菌，进而在再进行多抗生素耐受性检测和显微镜下单细胞复苏观察等验证。近年来，也偶有分子标记方法进行细菌进入持留状态的检测。结核分枝杆菌从生长繁殖期进入休眠持留期，原有的三羧酸循环会转向依赖乙醛酸循环支路的途径，在获取能量和碳源的同时降低代谢率，维持其在宿主细胞内长期生存的需要。因此，乙醛酸代谢途径的一个关键酶异柠檬酸裂合酶（Isocitrate cleavage synthase，ICL）是结核分枝杆菌胞内厌氧代谢的关键酶，其表达可用于指示结核分枝杆菌从活跃菌进行入了持留菌。

在细菌蛋白质翻译过程中，肽链延伸的移位过程需要延伸因子G（EF-G），EF-G与核糖体相互作用，以稳定其中间状态。EF-G的GTP酶活性在核糖体结合后被激活，利用GTP水解推动移位过程中的构象变化，促进蛋白质的合成。因此该过程是决定蛋白质合成肽键的关键过程，在灿烂弧菌中编码合成EF-G蛋白的基因为 fusA基因。

灿烂弧菌是海水养殖环境中常见的重要条件致病菌，可感染海参、扇贝、牡蛎、蛤和美国鱼类等多个海水养殖经济生物品种。灿烂弧菌可以通过进入持留菌状态，以避免抗生素和宿主免疫因子的杀灭，但是目前未见有关灿烂弧菌进入持留状态的指示基因的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单快速、准确判断细菌是否进入低代谢状态的 fusA基因的用途及其指示灿烂弧菌代谢水平高低的方法。