[发明专利]一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法

权利要求书

1.一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取一支大肠杆菌甘油冷冻管，按照1％-5％的接种比接入到LB种子培养基中，进行活化；

(2)将种子培养基放入摇床中，培养6-10h；

(3)将培养基进行分装和灭菌，灭菌完成后进行冷却，之后设定发酵培养的参数；

(4)将培养完成的种子转入发酵罐中，进行发酵培养30-36h，培养过程采用酸和碱调控pH值；

(5)发酵培养过程中，通过补加补料培养基维持大肠杆菌的生长；

(6)发酵培养过程中，将溶解氧与通气量、转速和通氧量进行联动；

(7)发酵培养过程中，通过升温-降温-升温的方式对温度进行调控。

2.根据权利要求1所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的摇床，其培养温度为30～37℃，转速为150～250rpm。

3.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵培养基包含以下成分：甘油3～10g/L、Ye酵母5～10g/L、AOF蛋白胨8～15g/L、磷酸氢二钾0.5～3g/L、磷酸二氢钾0.5～3g/L、硫酸铵0.5～1.0g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L、氯化钙0.5～2g/L、硫酸锰0.15～0.5g/L、生物素0.1～1mg/L、维生素B1 1～5mg/L、维生素B5 1～5mg/L、维生素B6 1～5mg/L和消泡剂0.1-0.5g/L。

4.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(3)中所述初始发酵培养的参数为：温度28～32℃，pH值6.8～7.2，转速150～350rpm，溶解氧设定值为20～40％，通气量0.3～0.5VVM，罐压为0.01～0.05MPa。

5.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(4)中所述酸为盐酸或/和磷酸，其浓度为400～500g/L。

6.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述碱为氨水、氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液；氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液的浓度为10～50g/L；碱溶液的组成为氨水+氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液；氨水：氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液＝1:1～5。

7.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述补料培养基包含以下成分：甘油500～600g/L、Ye酵母80～100g/L和消泡剂0.1～0.5g/L。

8.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(5)中，补料的开始时间为：8-9h，补料流速为1.2mL/(h·L)；9-10h，补料流速为1.6mL/(h·L)；10-11h，补料流速为2.0mL/(h·L)；14-15h，补料流速为4.2mL/(h·L)；17-18h，补料流速为7.6mL/(h·L)；19-20h，补料流速为11.2mL/(h·L)；21-22h，补料流速为16.8mL/(h·L)。

9.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述溶解氧与通气量、转速和通氧量进行联动的顺序为通气量、转速和通氧量；所述通气量范围为0.5～1.5vvm，所述转速为150～1300rpm，所述通氧量为＞0％。

10.根据权利要求1或2所述的一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，其特征在于，步骤(7)中，12～18h，温度升高为35-40℃；18-20h，温度降为28-32℃；20-32h温度升高至34-38℃。