[发明专利]一种提高大肠杆菌发酵生产质粒产量的方法

说明书

本发明公开了一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，包括如下步骤：将大肠杆菌种子接入到LB种子培养基中进行活化，然后转入发酵罐中进行高密度培养，通过补料和酸碱调控pH值，并为大肠杆菌的生长提供营养物质，发酵培养过程中将溶解氧与通气量、转速和通氧量进行联动，通过升温‑降温‑再升温的方式对温度进行调控。本发明优化了发酵和补料培养基配方，保证了菌体的高密度生长，通过添加各种微量元素，对代谢进行刺激和扰动，促进菌体的代谢，有利于质粒的复制与拷贝，菌体培养过程中通过多阶段控温，分别实现了菌体的积累和质粒的合成。解决了通常在大肠杆菌生产过程中质粒水平不稳定，产量偏低的问题，并且降低了生产的成本。

技术领域：

本发明涉及一种发酵方法，具体涉及一种大肠杆菌的发酵方法。

背景技术：

基因治疗作为一个高速发展的行业，是将DNA自身作为高效生物物质利用的一项医学技术。然而无论是体内还是体外基因转移都需要一种安全、无毒的工具来携带外源基因进入细胞内，这种工具被称为载体，质粒DNA作为一种新的非病毒转基因载体。宿主菌的选择是一个合适的重要环节，大肠杆菌因其培养要求低、生长迅速，遗传背景清楚和表达量高等优点，是生命科学研究的模式生物之一。并且大肠杆菌的高密度细胞培养技术(highcell density cultivation,HCDC)能够显著提高菌体发酵密度，最终提高产物的比生产率，达到提高质粒产量的目的。目前，大肠杆菌生产质粒时，由于质粒对菌体产生的负荷，因此存在着大肠杆菌的OD值较低从而导致质粒产量无法得到提高的问题。如何有效提高发酵大肠杆菌的OD值并提高质粒的产量已成为急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于，针对大肠杆菌生产质粒产量较低的情况，优化了发酵的配方及培养方式，提高了菌体的OD值和质粒产量。本发明通过优化发酵培养基配方保证前期菌体拥有足够的营养物质，通过添加各种微量元素，对菌体代谢进行扰动，促进菌体的代谢，有利于质粒的拷贝，菌体培养过程中通过多阶段控温，分别实现了菌体的积累和产物的合成。通过持续的补料实现了菌体的高密度生长。通过本发明所述的方法提高了质粒的产量，降低了生产的成本。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，包括如下步骤：

(1)取一支大肠杆菌甘油冷冻管，按照1％-5％的接种比接入到LB种子培养基中，进行活化；

(2)将种子培养基放入摇床中，培养6-10h；

(3)根据发酵培养基的配方配置发酵培养基，将培养基进行灭菌，灭菌完成后进行冷却，之后设定发酵培养的参数；

(4)将培养完成的种子转入发酵罐中，进行发酵培养30-36h，培养过程采用酸和碱调控pH值；

(5)发酵培养过程中，通过流加补料培养基维持大肠杆菌的生长；

(6)发酵培养过程中，将溶解氧与通气量、转速和通氧量进行联动；

(7)发酵培养过程中，通过升温-降温-再升温的方式对温度进行调控。

较佳的，步骤(2)中所述的摇床，其培养温度为30-37℃，转速为150-250rpm。

较佳的，步骤(3)中所述发酵培养基为：葡萄糖5-12g/L，甘油3-10g/L，Ye酵母5-10g/L，AOF蛋白胨8-15g/L，磷酸氢二钾0.5-3g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸铵0.5-1.0g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，氯化钙0.5-2g/L，硫酸锰0.15-0.5g/L，生物素0.1-1mg/L，维生素B11-5mg/L，维生素B5 1-5mg/L，维生素B6 1-5mg/L，消泡剂0.1-0.5g/L。