[发明专利]利用分子信标检测CHO核酸残留的方法及引物和试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测CHO核酸残留的引物组，包括第一引物和第二引物，所述第一引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第二引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明组合了两套引物和探针共同进行检测，通过组合设计，提高了检测灵敏度。同时，通过研发优化的试剂配方和一体化检测试剂，对生物制品中CHO核酸残留DNA检测具有准确性强、灵敏度高、可重复性好，特异性高的特点。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体指利用分子信标检测CHO核酸残留的方法及引物和试剂盒。

背景技术

生物制品中宿主细胞残留DNA具有潜在致瘤和传染风险,所以各国药品监管部门对DNA杂质的限量要求非常严格。美国药典在General Chapter 1130介绍了三种常用技术,但将在2015年颁布的新版(USP38-NF33)中增加全新章节(General Chapter 30)来进一步规范残留DNA检测的方法和标准物质。与1000号以上的章节不同的是,USP编号1000以内的章节详细规定了检测技术、系统适应性标准和标准物质。新版USP中将唯一推荐qPCR法作为生物制品中宿主残留DNA的标准方法。qPCR法的技术优势在于序列特异性高、灵敏度高、重现性好,可以为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可靠的检测手段。

CHO细胞是目前生物制品工程中广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，根据产品需要使用不同种表达系统表达。其中CHO表达系统能准确的转录、修饰表达的蛋白，使得修饰后的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能上最接近于天然蛋白分子；其次，CHO细胞既可贴壁生长，又可以悬浮培养，有较高的耐受剪切力和渗透压的能力，培养体积能达到1000L以上；再次，CHO细胞具有重组基因的高效扩增和表达能力；而且CHO具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化。因此，CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主，而生物制品中残留的CHO会造成产品不合格或对人体造成危害。

为了保证生物制品的质量，对于生物制品生产中各流程进行CHO检测和监控尤为重要，这种监测一般通过检测CHO DNA残留来实现。高灵敏度的检测方法可以更好的保障生物制品的质量。

目前，常用的检测都是根据药典提供的引物进行检测，但是对于要求极低残留的环节，尤其是放行检测和重要过程检测，对于CHO DNA的检测灵敏度提出了更高的需求。为了满足以上检测需求，故急需开发一种更灵敏的检测引物探针组和检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供利用分子信标检测CHO核酸残留的方法及引物和试剂盒，以克服现有技术中的不足。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种检测CHO核酸残留的引物组，包括第一引物和第二引物，所述第一引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第二引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

一种检测CHO核酸残留的探针组，包括第一探针和第二探针，所述第一探针的序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.6所示。

一种检测CHO核酸残留的试剂盒，包括第一引物、第二引物、第一探针和第二探针，所述第一引物序列如EQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第二引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二探针的序列如SEQID NO.6所示。

所述的试剂盒，优选地，所述第一引物和所述第二引物的加入比例为1：1。

利用分子信标检测CHO核酸残留的方法，包括如下步骤：

第一步，稀释标准品作为标准品样本DNA；