[发明专利]一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法

权利要求书

1.一种同步检测月季四种病毒的引物，其特征在于，包括四组引物对分别为：

苹果茎沟病毒引物对：

正向引物ASGV-F：5’-CTTTGCCGCTACTTCTA-3’，

反向引物ASGV-R：5’-TAACCCTCCAGTTCCAG-3’；

柑橘碎叶病毒引物对：

正向引物CTLV-F：5’-ATCTCAGAGGCAACACC-3’，

反向引物CTLV-R：5’-AGTCACATTCCCATCCA-3’；

李属坏死环斑病毒引物对：

正向引物PNRSV-F：5’-GATGAGATGAGGGCGTTAC-3’，

反向引物PNRSV-R：5’-GCACTTCCTGAACTACCG-3’；

月季C病毒引物对：

正向引物RVC-F：5’-ACTGACGCTGGCTTGTA-3’，

反向引物RVC-R：5’-GGGTAACTTCTCGGTATGA-3’。

2.使用如权利要求1所述的引物检测月季四种病毒的方法，其特征在于：包含以下步骤：

S1，提取待测样品总RNA，经反转录为cDNA并以其为模板，同时设置RNase free ddH₂O为空白对照；

S2，用所述的四组引物对对该四种病毒进行PCR扩增反应，得到PCR产物；

S3，将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的四组引物对的PCR产物分别为321bp、514bp、740bp和1072bp大小差异明显的四条扩增带。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的S2步骤中，反应程序使用降落式PCR扩增：95℃预变性5min；94℃变性30s，65-56℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环，每个循环降1℃；后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸10min；4℃终止反应。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的S2步骤中，PCR扩增的反应体系为：反应体系的总体积为50μL，含有1.25μL 5U/μL的ExTaq酶、5μL的10×Taq酶buffer、5μL2.5mmol/L的dNTPs、每病毒cDNA模板50-100ng、浓度为20μmol/L的苹果茎沟病毒正向引物ASGV-F及反向引物ASGV-R各0.75μL、浓度为20μmol/L的柑橘碎叶病毒正向引物CTLV-F及反向引物CTLV-R各0.75μL、浓度为20μmol/L的李属坏死环斑病毒正向引物PNRSV-F及反向引物PNRSV-R各1.0μL、浓度为20μmol/L的月季C病毒的正向引物RVC-F及反向引物RVC-R各0.5μL，加ddH₂O补足至50μL。