[发明专利]一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法

说明书

本发明涉及一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法，属于生物学领域，本发明所述的引物序列如SEQ ID.1‑8所示，使用本发明所述的引物一次反应就能同时检测出侵染月季的四种主要病毒即苹果茎沟病毒、柑橘碎叶病毒、李属坏死环斑病毒及月季C病毒，本方法具有特异性强、检测效率高、所需成本低、耗时短的特点，检测灵敏度达到fg级水平。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体的说，涉及一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法。

背景技术

月季(Rosa spp.)为常绿、半常绿低矮灌木，又名“月月红”、“玫瑰”，是我国五大主要切花之一，四季开花，花形优美，花期长，素有“花中皇后”的美称。月季切花产量占我国花卉产量的70％以上，创造了较高的经济价值，是目前极具竞争力和发展潜力的一种高经济价值的花卉，其在我国农村经济发展和乡村振兴建设中发挥着重要的作用。月季栽培通常为设施栽培，规模化生产种苗通常通过扦插繁殖来实现，长期无性繁殖导致病毒积累严重。苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leafvirus，CTLV)、李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)和月季C病毒(Rose virus C,RVC)是危害月季的四种主要病毒，在云南等月季主产区时有发生，据不完全调查，月季病毒病侵染率为20-30％，严重的可高达70％，感染病毒后，严重影响了月季的观赏和经济价值，使植株表现出花叶、坏死、畸形、花瓣变色、不开花或花期缩短等症状，使其品质严重下降，已成为制约月季产业发展的主要限制因素。目前国际上还没有防治植物病毒病的有效药剂，因此，有针对性地进行隔离检疫、销毁病株，或培育无毒种苗等，是防控病毒病的重要措施。而这些都需要对种苗及植株进行病毒检测，建立快速、高效、成本低的检测方法显得尤为重要。

目前，月季批量化病毒检测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附技术(ELISA方法)，但抗血清不仅价格较高、一种抗血清只能检测一种病毒、检测程序繁琐，而且还存在一定程度的假阳性反应、检测灵敏性、准确度相对较低等问题。近年来，为了提高病毒检测效率，基于PCR技术的病毒检测技术迅速发展，但多为普通单重PCR检测技术，一个反应体系只能检测一种病毒。但田间环境复杂，导致病毒侵染多为2种或2种以上病毒的符合侵染，在实际田间多种病毒复合侵染的月季病毒检测实际应用中，单重PCR则存在耗时、耗力、费用高的问题。鉴于此，近年来，国内外研究者逐步将多重RT-PCR技术运用到植物病毒检测，与单重PCR检测方法相比，多重PCR检测技术具有在一个RT-PCR反应中可同时检测出多种病毒，操作更为简单，具有检测时间缩短、实验成本降低等优点，检测时间和成本均分别降低3/4左右，四个病毒检测时间在5小时内完成。目前尚未发现采用多重RT-PCR检测技术同时检测月季植株组织中的ASGV、CTLV、PNRSV和RVC的相关文献报道。ASGV、CTLV、PNRSV和RVC多重同步检测的主要难点在于高扩增效率特异性引物的设计，反应体系的优化及反应程序的研究。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种同步检测月季四种病毒的引物，其特征在于，包括四组引物对分别为：

苹果茎沟病毒引物对：

正向引物ASGV-F：5’-CTTTGCCGCTACTTCTA-3’，

反向引物ASGV-R：5’-TAACCCTCCAGTTCCAG-3’；

柑橘碎叶病毒引物对：

正向引物CTLV-F：5’-ATCTCAGAGGCAACACC-3’，

反向引物CTLV-R：5’-AGTCACATTCCCATCCA-3’；

李属坏死环斑病毒引物对：