[发明专利]一种体外快速合成环状DNA的方法

权利要求书

1.一种体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.以基因组为模板，针对所需合成环状DNA对应的线性DNA片段分别设计正向引物和反向引物进行PCR，产生线性DNA-A片段；

S2.以步骤S1制得的DNA-A片段为模板，分别设计引物产生1/2A片段，分别为DNA-C片段和DNA-D片段；

S3.将步骤S2制得的1/2A片段进行梯度退火，产生黏性DNA-C片段和DNA-D片段；

S4.用T7连接酶连接步骤S3制得的黏性DNA-C片段和DNA-D片段；

S5.以步骤S4制得的DNA片段为模板，再进行PCR，产生DNA-E片段；

S6.将DNA-A片段和DNA-E片段经过TaqDNALigase试剂进行成环反应，制得环状DNA。

2.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，设计1/2A片段的引物设计为互补结构。

3.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S1中所述PCR体系如下：2*PCR缓冲液forKODFX20-30μL，2mMdNTPs8-12μL，F-Primer1-2μL，R-Primer1-2μL，GenomicDNA180-220ng，KODFX0.5-1.5μL，ddH₂O加至50μL。

4.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S1中所述PCR反应条件为：90-96℃，2min；95-100℃，10s，50-60℃，30s，65-75℃，3min，30循环；3-5℃，∞。

5.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S2和步骤S4的反应体系和反应条件与步骤S1相同。

6.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S3的反应体系如下：DNA-C片段20μL，DNA-C’片段20μL，5*DNAAnnealing缓冲液10μL，总计50μL。

7.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S3的反应条件如下：90-100℃，3min；85-95℃，3min；80-90℃，3min，以每下降5℃维持3min，梯度降温至25℃。

8.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S4的反应体系如下：DNALigaseReaction缓冲液10μL，黏性DNA-C片段5μL，黏性DNA-D片段5μL，DNAliagse1μL，总计21μL；反应条件：25℃，30min-1h，失活：65℃，20min。

9.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S6的反应体系如下：DNA-A片段400-600ng，DNA-E片段400-600ng，TaqDNA LigaseReaction缓冲液6-8μL，TaqDNALigase1-3μL，ddH₂O补足至50μL。

10.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S6的反应条件如下：90-100℃，3min，55-65℃，10min，35-40℃，5min，10循环。