[发明专利]一种体外快速合成环状DNA的方法

说明书

本发明提出了一种体外快速合成环状DNA的方法，属于基因工程技术领域。包括：S1.以基因组为模板，针对所需合成环状DNA对应的线性DNA片段分别设计正向引物和反向引物进行PCR，产生线性DNA‑A片段；S2.以DNA‑A片段为模板，分别设计引物产生1/2A片段；S3.将1/2A片段进行梯度退火，产生黏性1/2A片段；S4.用T7连接酶连接黏性1/2A片段；S5.以黏性1/2A片段为模板，再进行PCR，产生DNA‑E片段；S6.将DNA‑A片段和DNA‑E片段经过TaqDNA Ligase试剂进行成环反应。本发明可成功构建特定序列单个eccDNA，可合成长链高浓度eccDNA，经济快速。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种体外快速合成环状DNA的方法。

背景技术

染色体外环状DNA(Extrachromosomal circμLar DNA,eccDNA)是真核生物中一类特殊的环状DNA，最早的报道见于1965年，是部分基因组DNA在一定条件下从染色体上脱落，通过一系列复杂机制成环，形成的环状DNA，其大小从100bp到数百万bp不等,可来源于基因组的不同位点。EccDNA能通过多种途径在生理及病理过程中发挥重要的作用，一些研究认为许多重要的原癌基因主要以eccDNA为载体进行扩增,表明它与肿瘤细胞癌基因拷贝数增加和基因转录水平提高相关，同时与肿瘤的异质性，转移，耐药以及不良预后相关。然而，单个eccDNAs的功能在很大程度上是未知的。主要问题之一是缺乏有效和稳定的方法来在体外合成单个eccDNA用于下游测定以探索其功能。

目前，体外合成eccDNA可以通过使用Taq DNA连接酶(参考文献：Du,Q.,Kotlyar,A.and Vologodskii,A.(2008)Kinking the double helix by bendingdeformation.NUCLEICACIDSRES,36,1120-1128.)和T4 DNA连接酶(参考文献：Kuhn,H.andFrank Kamenetskii,M.D.(2005)Template-independent ligation of single-strandedDNAby T4 DNAligase.TheFEBSjournal,272,5991-6000.)等方法合成。长度为84～106bp的小环可通过Taq DNA连接酶合成。这种方法受DNA长度的限制，而合成长链DNA(100bp)的价格昂贵。后来，引入了一种非模板连接方法，通过T4 DNA连接酶将HindⅢ粘性末端的DNA自连接成环，这种连接反应需要0.1-10nm范围内的非常低的DNA浓度来抑制分子间连接，因此产量非常低。Henrik Devitt et al.最近研究表明(参考文献：H.D.,Lin,L.,Xiang,X.,Petersen,T.S.,Huang,J.,Yang,L.,Kjeldsen,E.,Jensen,U.B.,Zhang,X.and Liu,X.et al..(2018)CRISPR-C:circμLarization of genes and chromosome byCRISPR in human cells.NUCLEICACIDSRES.)，CRISPR-C可以从基因间和基因位点生成eccDNA，大小范围从几百个碱基对到207kb不等，但这种方法需要一个特定的基因编辑系统，耗时且复杂。是否能深入研究特定序列eccDNA的功能，迫切需要开发一种快速、稳定的方法来合成长度范围广的eccDNAs。

发明内容

本发明的目的在于提出一种体外快速合成环状DNA的方法，通过PCR方法提供一种体外简单快速合成eccDNA的方法。该方法成功的解决了以往合成eccDNA的长度限制以及浓度限制的两大关键问题，为eccDNA的分子机制研究提供了可能方案。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种体外快速合成环状DNA的方法，包括以下步骤：

S1.以基因组为模板，针对所需合成环状DNA对应的线性DNA片段分别设计正向引物和反向引物进行PCR，产生线性DNA-A片段；