[发明专利]检测槲叶褐斑病病原菌的引物组、试剂盒及方法和应用

说明书

本发明属于基因检测技术领域，具体公开检测槲叶褐斑病病原菌的引物组、试剂盒及方法和应用，设计了槲叶褐斑病的PCR检测引物及槲叶褐斑病病原菌的核糖体ITS基因，该引物特异性好，灵敏度高，并建立了高效、快速和特异性检测槲叶褐斑病病原菌Botryosphaeria spp.的方法和检测试剂盒，在检测槲叶褐斑病病原菌Botryosphaeria spp.中具有非常广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是一种检测槲叶褐斑病病原菌的引物组、试剂盒及方法和应用。

背景技术

槲叶褐斑病是近年来在辽宁大部分蚕区出现的柞树新病害，为害槲叶。近些年，在辽东部分蚕种场，以及辽宁北部蚕区发现槲叶褐斑病，并呈现出较快的蔓延趋势，影响了广大蚕农经济效益和从事养蚕业的积极性。

槲叶褐斑病(主要是槲叶褐斑病病原菌Botryosphaeria spp.)一般发生在7～8月间，首先危害槲树的下位叶，在叶片病斑扩大的同时，扩展到危害枝条的上位叶；槲叶病斑初期为褐色水渍状同心轮斑斑点(直径0.5～1cm)，随着病情加重，直径可达4～5cm，直至槲叶病斑中心破裂变成孔洞，导致饲料价值丧失，随着病程加剧，在柞蚕盛食期受害严重，制约柞蚕生产的进行。

目前尚未有有效的防控手段，早期监测显得尤为重要。但是目前也尚未建立相应的检测方法，槲叶褐斑病导致的蚕区经济效益降低日益严重，因此，亟需建立一种可对槲叶褐斑病的病原菌进行检测和鉴定的方法，以便于做好早期防控。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测槲叶褐斑病病原菌的引物组、试剂盒及方法和应用，能够高效、快速和特异性检测槲叶褐斑病病原菌Botryosphaeriaspp.。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

本发明的第一个目的是要提供一种检测槲叶褐斑病病原菌的引物组，包括：

上游引物：5’-CCTACCTCTGTTGCTTTGGC-3’；

下游引物：5’-CTCCGAAGCGAGATGTATGT-3’。

本发明的第二个目的是要提供一种检测槲叶褐斑病病原菌的引物组在检测槲叶褐斑病病原菌中的应用。

本发明的第三个目的是要提供一种槲叶褐斑病病原菌的核糖体ITS基因，以感染槲叶褐斑病病害的槲树叶片的总DNA为模板，利用所述的检测槲叶褐斑病病原菌的引物组进行PCR扩增获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第四个目的是要提供一种包含所述的检测槲叶褐斑病病原菌的引物组的检测槲叶褐斑病病原菌的试剂盒。

进一步地，该试剂盒还包括2×Taq Master Mix，Template DNA，ddH₂O。

本发明的第五个目的是要提供一种检测槲叶褐斑病和/或槲叶褐斑病病原菌的方法，以待测样本的总DNA为模板，利用权利要求1或4所述引物组后试剂盒进行PCR扩增；将PCR扩增反应的产物进行凝胶电泳，出现大小为400-500bp的扩增条带，则判定待测样本为槲叶褐斑病阳性样本或含有槲叶褐斑病病原菌；或将回收大小对应的PCR产物片段进行Sanger测序，然后将测序结果与槲叶褐斑病病原菌的核糖体ITS基因序列进行比对判定待测样本是否含有槲叶褐斑病阳性样本或含有槲叶褐斑病病原菌。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq Master Mix 10μL，10μM以上上游引物1.0μL，10μM以上下游引物1.0μL，Template DNA 1μL，余量用ddH₂O补足，共25μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃，3min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；35个循环；72℃，5min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：