[发明专利]基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种基于突变扩增阻滞系统检测不同SARS‑CoV‑2突变株的引物探针组合、试剂盒及应用，属于病原分子生物学检测技术领域。其中，所述引物探针组合包括分别用于检测S基因的突变位点的引物和探针，所述突变位点包括△69‑70 aa、V126A、△242‑244 aa、K417N、K417T、L452R、E484K、E484Q、E484A、N501Y、P681R、P681H和F888L，所述试剂盒包括所述引物探针组合及阴性质控品和阳性质控品。利用本发明的试剂组合和试剂盒进行SARS‑CoV‑2突变株检测，具有成本低、高效和易推广的特点，具有十分重要的临床应用价值。

技术领域

本发明属于病原分子生物学检测技术领域，具体地，涉及基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合、试剂盒及应用。

背景技术

突变扩增阻滞系统（Amplification-refractory Mutation System，ARMS），又称等位基因特异性聚合酶链反应（Allele-specific Polymerase Chain Reaction，ASPCR），是基于PCR技术建立的分析方法。该方法一建立就受到人们广泛关注，并迅速得到应用，包括肺癌组织EGFR突变、镰刀状细胞贫血症、苯丙酮尿症、β地中海贫血症等癌症和遗传病疾病检测。并且，ARMS法在基因分型方面也已经展现其独特优势，比如人类白细胞抗原（HLA）分型、ABO血型基因分型等。

ARMS法是利用DNA聚合酶缺乏3'-5'端外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能实现扩增的原理。ARMS扩增条件与PCR所需条件基本一致，但其引物的3'端不配对的核苷阻滞影响了DNA聚合酶的延伸效率，使与ARMS引物存在一个碱基差异的等位基因也不能被扩增，因此ARMS可以区分模板中单个核苷酸差异。但这种阻滞程度依赖于错配碱基的类型。研究发现，C/T、A/A、T/T（嘌呤/嘌呤、嘧啶/嘧啶）错配比G/T、T/G、A/C、C/A（嘌呤/嘧啶）错配对聚合酶催化效率的影响更大。当一对3'末端错配碱基不足以阻滞扩增反应时，近末端必须增添其它错配碱基加强阻滞作用。有时为了能最大限度地提高引物与靶DNA结合的特异性，常常将引物的3'端倒数第二个核苷也设计为错配碱基。但由于ARMS扩增反应条件复杂，改变一些因素就会影响扩增结果，加之PCR扩增条件不尽相同。因此，对于不同反应体系的最佳错位位点、引物类型、反应的温度、时间等条件都需要验证确认以获得最优的PCR反应体系统。

国际世卫组织（WHO）将值得注意的新型冠状病毒（severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的变异株分为“监测中的变异株”（VUM，VariantsUnder Monitoring）、“需留意的变异株”（VOI，Variants of Interest）以及“需关注的变异株”（VOC，Variants of Concern），截至2022年11月，出现过的VOC包括B.1.1.7（α）、B.1.351（β）、P.1（γ）、B.1.617.2（δ）和B.1.1.529（Omicron），VUM和VOI包括B.1.617.1（κ）、B.1.525（η）和B.1.620等。

SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，是一种单链正链RNA病毒，其基因组编码四种结构蛋白：核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）。其中，刺突蛋白是I型融合蛋白，在病毒粒子表面形成三聚体，由两个亚基组成，S1负责受体结合，S2负责膜融合。刺突蛋白决定了病毒的传染性及其在宿主中的传播能力，但突变是病毒复制过程中的自然现象，而RNA病毒的突变率高于DNA病毒。刺突蛋白的氨基酸变化可以显著影响病毒功能，比如ΔHV69-70、L452、E484、N501分别与病毒的免疫逃逸和/或血管紧张素转换酶（ACE，病毒进入靶细胞的受体）亲和力相关，而P681则与Furin蛋白酶切位点有关等。不同的突变位点出现在SARS-CoV-2不同变异株中，从而使不同变异株具有其相应的特点。

目前快速对SARS-CoV-2变异株进行检测的手段仍然十分有限。

发明内容